帕金森病（Parkinson’s disease，PD）是常见的神经退行性疾病之一。最主要的病理表现为黑质纹状体多巴胺能神经系统的损伤，及神经细胞内ɑ-synuclein表达增多及其进一步聚集形成的路易氏体（Lewy body, LB）沉积。

实验动物： 8-10周龄SD雄性大鼠，用作种公鼠和结扎公鼠；4-6周龄雌性大鼠，用作超数排卵，8~10周龄雌性大鼠，用作受体。 主要试剂： 孕马血清促性腺激素(PMSG)，人绒毛膜促性腺激素(hCG)，M2培养液(M7167，Sigma)，M16培养液(M7292，Sigma)，体外转录试剂盒(Ambion)，PCR试剂盒(Takara)，luciferaseSSA检测试剂盒，琼脂糖等 主要仪器： 低温超速离心机，PCR仪，电泳仪，Leica体视镜，显微注射系统，超净工作台，培养皿(BD Falcon)，一次性注射器，无菌手术器械(剪刀、镊子、血管夹、持针器、手术缝线等)等 实验环境： 普通实验室内进行质粒构建与显微注射。SD大鼠饲养于SPF屏障环境。 实验操作规程： 供体与受体准备 供体雌鼠超数排卵：选择 4-6 周龄的雌鼠，于腹腔注射 PMSG 20 IU/只，48 h后注射hCG 20 IU/只，按1:1的比例与成年雄鼠合笼，于次日早上观察雌鼠阴栓，见栓雌鼠取卵用于显微注射。雄鼠结扎：选8-10周龄雄性大鼠，腹腔注射戊巴比妥钠(40 mg/kg体重)麻醉后剪毛，75%酒精消毒，腹中线下方距阴茎2-3 cm处剪开皮肤肌肉，分别分离出两侧输精管，将镊子在酒精灯上加热后烧断输精管，关闭腹腔，待恢复2周后用于和雌鼠交配准备受体。受体假孕鼠制备：于取卵前1 d选择成年雌鼠与结扎雄鼠合笼，次日早上观察雌鼠阴栓，见栓雌鼠即作为假孕鼠用作受精卵移植。 TALEN 质粒的准备 TALEN设计靶位点位置: exon2上，kinase 的domain 前5’-T GGACACACGACGTTGGC agggcttccgcctgga GGATTATCTGATAGGAC A-3’。将构建的 TALEN质粒对分别取 10 µg 酶切线性化，酚氯仿抽提、纯化后取 1 µg 作模板，按照体外转录试剂盒的说明依次加入 NTP/CAP、10×Buffer 及 Enzyme Mix，最后加水至20 µl转录体系，于37℃水浴2 h。转录后纯化、鉴定，分装保存于-80℃冰箱。 图1. 组装后的TALEN质粒。 胚胎收集 将见栓雌鼠颈椎脱臼处死，75%酒精消毒后迅速剪开腹腔，分离卵巢输卵管和子宫，剪下输卵管置于37℃预热的M2液滴中，在体式镜下将输卵管膨大部划开，释放出卵丘-卵母细胞复合体。透明质酸酶消化去除颗粒细胞后，于M2培养液滴中洗3-5次后，移入覆盖有矿物油的M16培养液中培养以备显微注射。 显微注射 显微镜下观察可见清晰原核的卵细胞为受精卵，挑选出用于显微注射。将TALEN质粒对转录的mRNA中放入注射针虹吸，注射针尖端充满液体后安装于注射仪上，根据注射针的出液量多少调节注射压力，注射后可见胞质有明显膨胀表明成功注射入胞质。将成功注射且存活的受精卵用于输卵管移植。 输卵管移植 将见栓的假孕鼠戊巴比妥钠腹腔注射麻醉(40 mg/kg体重)，背部脊柱两侧肋骨下方剃毛，75%酒精消毒后依次剪开皮肤肌肉，可见白色脂肪体，用镊子夹住脂肪体向外牵拉出卵巢、输卵管、子宫，在体视镜下找到输卵管膨大部，用血管夹夹住脂肪体以固定输卵管在镜下合适的位置，在输卵管膨大部前方避开血管走形剪开一小口，将移卵管插入开口吹入胚胎，液体后方吹入一气泡防止液体反流。将脂肪体、卵巢、输卵管及子宫还纳入腹腔，缝合肌肉皮肤。 6. 出生大鼠鉴定 将受精卵移植的假孕鼠 单笼饲养22 d左右后观察乳鼠出生情况。新生鼠生长至 1 周以上即剪脚趾，消化液 55℃水浴消化过夜后，常规方法提基因组。对目的基因进行 PCR 扩增后送测序鉴定。 动物伦理： 用于实验的SD大鼠购自维通利华，饲养于SPF屏障环境。饲养条件为温度(24±2)℃，湿度为(50±10)%，光照周期为6:00~18:00，12 h昼夜交替。本实验中动物的使用已获得中国医学科学院医学实验动物研究所实验动物使用与管理委员会（ICUC）批准（QC18011）。

本模型可用于结核等多种与巨噬细胞免疫相关的疾病的程序性死亡配体（PD-L1）功能机制研究。目前不涉及特定疾病

包括实验材料（实验动物、试剂、仪器）、实验环境、细胞培养/载体构建/蛋白表达/病原培养鉴定方法、实验操作规程、动物处理伦理等内容。 （一）巨噬细胞上特异性小鼠制备的原理 条件性基因敲除小鼠的设计利用了位点特异性重组酶系统Cre/LoxP原理，需要在待敲除的一段目标DNA序列的两端各放置一个loxP序列，得到flox(flanked by loxP)小鼠。将flox小鼠与带有组织或细胞特异性表达cre的小鼠交配繁殖，以获得在特定细胞或者组织里把目的基因敲除掉的小鼠，即条件性基因敲除小鼠。 如下图： 图1 特异性敲除的原理 （二）条件敲除小鼠的繁殖和鉴定 1.  收到F0和F1小鼠后，首先确认每只小鼠的脚趾编号是否吻合。 2.  F0和F1小鼠由于数量较少，以后需要的动物多，与野生交配，尽量多繁殖，以备后续的研究。 3. 获得小鼠后，提取基因组DNA，PCR扩增，进行基因型鉴定，并利用流式进行表型鉴定。 4. 繁殖方法有多种，以下为一种举例： 首先将PD-L1Flox/-小鼠和C57BL/6小鼠进行杂交，得到PD-L1Flox/-小鼠，然后将PD-L1Flox/-小鼠进行自交，得到PD-L1Flox/Flox小鼠，将雌性PD-L1Flox/Flox小鼠和带有巨噬细胞特异性表达 Cre 酶的Lyz2-iCre雄鼠进行杂交，得到 PD-L1Flox/- with Cre小鼠，最后将PD-L1Flox/Flox小鼠和PD-L1Flox/- with Cre小鼠杂交，得到1/4的PD-L1Flox/Flox with Cre小鼠，即为巨噬细胞特异性PD-L1敲除小鼠。   备注：PD-L1Flox/-小鼠由中国医学科学院医学实验动物研究所基因工程平台采用CRISPR/Cas9技术构建。巨噬细胞特异性PD-L1敲除小鼠繁育过程所需的6周龄 SPF 级C57BL/6小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司【SCXK(京) 2018－001】，6周龄SPF级雄性Lyz2-iCre小鼠2只，购自南京大学模式动物中心。小鼠均饲养于中国医学科学院医学实验动物研究所屏障环境动物房【SYXK(京)2014－0029】，饲养间温度( 23 ± 2) ℃，12 /12 h 明暗交替照明，动物自由饮水及采食。动物实验中涉及动物的操作程序已经得到中国医学科学院医学实验动物研究所实验动物使用与管理委员会( IACUC) 的批准，批准号为 ZLJ19003。

黑色素瘤指有恶性变化的色素斑痣，是由交界痣或混合痣性质的痣发展而来。虽然不一定由斑痣恶变，但是慢性刺激和不恰当的治疗对斑痣转变成黑色素瘤有很大的关系。黑色素瘤表现为黑痣突然出现或迅速长大，色泽不断加深，四周出现彗星状小瘤或色素环，局部发生疼痛、感染、溃疡或出血，出现肿大的淋巴结。肿瘤为单一实性，常有包膜，颜色可黑色、红棕色，深浅程度不一，也可无色素性。大多数黑色素瘤是原发性的，累及成人和儿童，特别是有神经皮肤症状的儿童。肿瘤好发于下肢，其次是头、颈、上肢、眼、指甲下和阴唇等处。早期即能由淋巴道和血行转移至肝、脑、骨、黏膜等处。经常受摩擦的手掌、足底和眼部的黑痣以及位于表皮和真皮交界处的黑痣容易恶变，被认为是黑色素瘤的前驱期。

包括实验材料（实验动物、试剂、仪器）、实验环境、细胞培养/载体构建/蛋白表达/病原培养鉴定方法、实验操作规程、动物处理伦理等内容。 （一）GPR68 Ko小鼠的构建 1、实验设计 根据GPR68蛋白保守区和基因组结构，设计需要删除的外显子。GPR68基因存在多种转录产物，但根据GPR68基因组结构和蛋白功能保守区，只有一个蛋白编码区exon1。因此在exon1的两边设计gRNA靶点，将exon1进行全身性敲除。 图2 插入位点设计 2、Cas9/gRNA的活性检测 采用北京唯尚立德Cas9/gRNA靶点效率检测试剂盒检测gRNA靶点体外酶切活性。选体外活性高的gRNA显微注射受精卵，取胚胎检测內源活性。根据Cas9/gRNA的內源活性结果，选用活性较高的gRNA进行后续实验。 3、基因敲除小鼠的建立和和品系交配 选取活性高的CRISPR体外转录成RNA，显微注射到小鼠受精卵中，得到发生基因突变的首建者小鼠（founder）。对小鼠进行基因型鉴定，获得发生期望突变的founder小鼠。通过基因组DNA的PCR进行基因型的鉴定，若发生DNA片段删除，将出现特异的缩短的PCR产物。 4、稳定遗传的Gpr68敲除小鼠品系的建立 将带有突变的founder小鼠与野生型小鼠交配，得到基因突变的杂合子小鼠（+/-）F1代，并进行DNA测序，确认目标基因发生的DNA片段删除，从而目标蛋白被失活，实现基因敲除。 基因型相同的杂合子小鼠（+/-）相互交配，得到基因敲除的纯合子小鼠（-/-）F2代。大约有1/4几率的F2后代小鼠是基因敲除的纯合体小鼠。 （二）皮下移植黑色素瘤模型的构建 1、用0.25%胰酶消化细胞收集细胞悬液，用预冷的PBS重悬细胞，1000rpm离心5min，洗涤细胞两次，除去单细胞悬液中的血清。 2、对细胞进行计数，用PBS稀释细胞至浓度为2.5×106个/mL，接种体积控制在0.2mL。 3、采用1mL无菌注射器于小鼠腋下部位接种细胞。接种时将单细胞悬液充分混匀，防止细胞成团导致活性降低以及接种细胞数不均，左手固定小鼠，右手执注射器，针头在皮下穿行时避免刺破皮肤与肌肉，到达接种位点并注射完毕后退出针头时避免细胞悬液溢出。 4、每3天用游标卡尺测量肿瘤大小，测量肿瘤最长和最短直径。肿瘤体积计算公式为V=a×b2/2(a为长轴，b为短轴)。 5、接种后第20天实验结束，采用颈椎脱臼法处死小鼠，解剖取出肿瘤组织，称量小鼠肿瘤重量、脾脏重量。

[1]李维莎,刘宏飞,严立波,等. OGR1与肿瘤微环境 [J]. 中国比较医学杂志, 2019, 29(7):96-101. [2]Wenlong Zhang,Yong Han,Weisha Li，et al. Clinical data analysis reveals the role of OGR1 (GPR68) in head and neck squamous cancer[J]. Animal Models and Experimental Medicine，2019，2（4）.（已接收）

骨发育异常老年样皮肤（gerodermia osteodysplastica 或geroderma osteodysplasticum, GO症），又称瓦迪侏儒症（Walt Disney dwarfism），OMIM231070，是遗传性皮肤松弛症（Cutis laxa，CL）的一种，主要累及皮肤、骨骼等组织器官，是一种常染色体隐性遗传的罕见病。。Hennies 等针对13 个家系的研究发现GO 症的发病与一个高尔基体蛋白GORAB 的突变有关。GO 症和其他皮肤松弛症（CL）类似，主要累及结缔组织，这类疾病主要的可见临床表现就是皮肤缺乏弹性、松弛下垂，具有高度的异质性。

购买ES 细胞克隆XG183，该克隆中一个基因捕获载体（SA β -geo）被插入Gorab 基因第一个内含子中（图1）（购自BayGenomics 公司，USA）。按照说明书的相应标准和程序培养ES 细胞，并进行囊胚（C57BL/6）注射，然后通过胚胎移植将注射后的囊胚移植入代孕母鼠体内；将得到的嵌合体小鼠与亲本小鼠（C57BL/6）进行回交，得到F1 代小鼠。捕获载体的表达干扰了Gorab 基因的剪接，最终出现Gorab 第一外显子和β -geo 的融合表达。 图1：Gorab基因打靶策略和预测转录本

1. Liu Ying，Snedecor Elizabeth R，Choi Yeon Ja，Yang Ning，Zhang Xu，Xu Yuhuan，Han Yunlin，Jones Evan C，Shroyer Kenneth R，Clark Richard A，Zhang Lianfeng，Qin Chuan， Chen Jiang， Gorab Is Required for Dermal Condensate Cells to Respond to Hedgehog Signals during Hair Follicle Morphogenesis., J Invest Dermatol, 2016, 136(2):378-386. 2. Liu Ying, Chen Xi, Choi Yeon Ja, Yang Ning, Song Zhongya, Snedecor Elizabeth R., Liang Wei, Leung Elaine Lai-Han, Zhang Lianfeng, Qin Chuan, Chen Jiang, GORAB promotes embryonic lung maturation through antagonizing AKT phosphorylation, versican expression and mesenchymal cell migration., FASEB JOURNAL, 修回

我们的模型研究结果证实PON1敲除损伤免疫T细胞的发育，并显著调节神经免疫细胞——小胶质细胞的极化，之前的文献报道揭示了PON1参与抑制单核-巨噬细胞的分化，均提示PON1可作为一种新的免疫调节因子。该动物模型涉及到小胶质细胞相关的炎症反应和T细胞发育两方面，分述如下： 小胶质细胞是脑内常驻的免疫细胞，数量约占人脑细胞总数的0.5-16.6%，又称脑内的巨噬细胞，构成中枢神经系统的第一道防线。生理状态下的小胶质细胞处于相对的静息状态，因此被称为静息型小胶质细胞 (resting microglia)。静 息型小胶质细胞在发育的神经系统中起着调控神经元存活和修饰突触的作用，并且在成熟的健康脑中具有探测和调控神经元活动的功能；在炎症刺激病理状态下，包括在脑损伤、病原入侵以及退行性疾病中，小胶质细胞首先启动，迁移至损伤部位，转化为激活状态，呈现阿米巴虫样的典型巨噬细胞形态，因此被称为阿米巴样小胶质细胞(amoebic microglia)。小胶质细胞激活大体分为M1经典激活型和M2选择激活型。M1型为促炎状态，小胶质细胞释放大量的促炎性细胞因子如肿瘤坏死因子α、白介素1β、白介素6或白介素12，这些炎性因子会对神经细胞产生毒性作用, 严重的会致使神经细胞凋亡；M2型为抗炎状态，能够释放抗炎性细胞因子如白介素4、白介素13，吞噬损伤的神经细胞碎片、促进组织修复和神经元的再生。 神经炎症反应是许多神经退行性病变的重要病理基础，在神经系统创伤后的神经退变中也发挥重要作用。小胶质细胞通过吞噬作用清除细胞碎片，并释放神经生长及抗炎因子而减轻神经损伤，促进组织修复。然而很明显，小胶质细胞高度活化状态可释放高水平的促炎因子及细胞毒性物质，从而造成神经元失能及细胞死亡。神经系统损伤后，活化的小胶质细胞及浸润的巨噬细胞具有异质性。 胸腺是机体的重要免疫器官，由皮质和髓质两部分组成，主要包括胸腺上皮细胞和T淋巴细胞。T淋巴细胞(T细胞)是淋巴细胞的一种,在免疫反应中扮演着重要的角色。T细胞在胸腺中发育经历CD4-CD8-(Double negative,DN)、CD4+ CD8+(Double positive,DP)及CD4+或CD8+(Single positive,SP)三个主要阶段,最后进入外周淋巴组织。胸腺病变将对机体免疫功能带来严重影响，使机体免疫自稳功能紊乱并伴发自身免疫性疾病。但是，目前对于胸腺发育和T淋巴细胞产生的分子机制仍不清楚。

1. 实验材料 1.1实验动物 SD大鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司和北京华阜康生物科技股份有限公司。 1.2主要实验仪器 Nikon显微注射仪 Nikon光学显微镜 BIO-RAD电泳仪 Tanon电泳槽 Tanon数码凝胶图像处理系统 Incucell恒温培养箱温控 TAITEC振荡箱 Eppendorf 离心机 Eppendorf 移液器 2.实验操作规程和动物处理伦理 模型制作中涉及动物的操作程序已获得中国医学科学院医学实验动物研究所实验动物使用与管理委员会的批准，批准号为ZLF18003，简要步骤如下： 2.1 供卵雌鼠超排 实验第一天8：00 腹腔注射PMSG 30IU/只(0.6ml／只)，46～48h以后，实验第三天10：00 腹腔注射HCG 30IU/只(0.6ml／只)，注射HCG后立即与与种鼠1：1合笼。实验第四天8：00～9：00检查阴道栓，有阴道栓的大鼠在大鼠标牌上注明日期和⊕（阳性），捡出有阴栓的大鼠进行受精卵的收集。 2.2受精卵的收集   2%戊巴比妥钠麻醉大鼠，脱颈处死，解剖大鼠，找到卵巢，输卵管和子宫，将卵取出，用透明质酸酶消除胚泡的黏着，使卵分离。在移换到另外的培养液中，要将透明质酸酶充分洗净（洗约3~5次）。 2.3 向受精卵雄性原核注入DNA溶液 2.4. 仅将未损坏的完成操作的卵收集起来，移植到假妊娠大鼠输卵管中。术后将大鼠置于安静的环境下饲养。 2.5 基因表型鉴定 在判定有导入基因大鼠之后，立即将基因修饰大鼠另行饲养，对不用的大鼠进行处理。阴性大鼠的处理：（1）留和阳性大鼠等量的阴性大鼠对照。（2）剩余的阴性大鼠用于其它符合动物伦理的其他实验室的实验（保存记录）。 3. PON1基因敲除靶点设计与测序鉴定 利用CRISPR/Cas9 技术建立基因敲除大鼠，sgRNA 的作用靶点位于第四外显子。通过显微注射成功获得敲除大鼠，其中首建鼠F0（#20）敲除片段大小为342bp，能够稳定传代。PON1 杂合子大鼠之间杂交得到同窝阴性对照大鼠和敲除纯合子用于实验研究。大鼠模型资源详见（SD.Pon1(tm)-GC/ILAS，http://www.ratresource.com） 图1 PON1基因敲除设计策略

心力衰竭，简称心衰，是指由于心脏收缩和（或）舒张功能障碍，无法将静脉回心血量充分排出心脏，导致静脉系统血液淤积，动脉系统灌注不足，从而引发心脏循环障碍症候群，心衰并不是一个独立的疾病，而是所有心血管疾病发展的终末阶段。 近年来，随着我国社会老龄化和高血压，冠心病等心血管疾病发病率的增加，使得心衰呈现高发病率，高致残率和高死亡率的特点，《2018中国心力衰竭诊断和治疗指南》中报道我国心衰患病率为0.9%，有1000万左右的心衰患者。 几乎所有的心血管疾病最终都会导致心衰的发生，而在基础性心脏病的基础上，一些因素亦可诱发心衰的发生，常见诱因包括，感染，严重心律失常，心脏负荷增大，药物中毒（如洋地黄）等等。 心衰在临床上可分为急性心衰和慢性心衰。临床表现，包括呼吸困难，运动耐力下降，心室腔增大，心脏功能下降（LVEF<40-50%），心脏顺应性降低，心室腔内淤血，肺循环及体循环淤血。 临床检查手段，包括超声影像分析，心电图，心衰标志物（B型利钠肽（BNP），N末端B型利钠肽原（NT-proBNP））心肌坏死标志物（心肌肌钙蛋白T（cTnT）及心肌肌钙蛋白I（cTnI））。 临床治疗方法，包括强心（米力农，地高辛），利尿（速尿），抗感染，改善心肌重构（卡维地洛）及心脏移植。

3.1 实验材料 3.1.1 实验动物 SD大鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司【SCXK（京）2012-001】。实验中涉及动物的操作程序已获得中国医学科学院医学实验动物研究所实验动物使用与管理委员会的批准，批准号为ZLF18003. 3.1.2实验仪器 仪器及耗材 生产厂商 NanoZoomer S60数字病理切片扫描仪 日本滨松光子学株式会社 Vevo770小动物超声影像系统 VisualSonics 激光共聚焦扫描显微镜 Leica 透射电子显微镜 JEOL 显微注射仪 Nikon 光学显微镜 Nikon 化学发光凝胶成像系统 BIO-RAD PCR仪 BIO-RAD 组织脱水机 Leica 石蜡切片机 Leica 石蜡包埋机 Leica 冰冻切片机 Leica 电泳仪 BIO-RAD 电泳槽 Tanon 数码凝胶图像处理系统 Tanon 组织匀浆机 POLYTRON 恒温培养箱 温控振荡箱 Incucell TAITEC 离心机 Eppendorf 摇床 SCILOGEX 塑料薄膜封口机 德清拜杰有限公司 电动鼓风干燥箱 天津市泰斯特仪器有限公司 电子称量器（量程0.5g-620g） 奥豪斯仪器（常州）有限公司 电子称量器（量程0.1mg-220g） Sartorius 4℃冰箱 海尔集团 -80℃冰箱 SANYO -20℃冰箱 SANYO 涡旋振荡器 上海沪西分析仪器厂 移液器 Eppendorf   3.1.3实验试剂 试剂 生产厂商 体外转录用试剂盒 Ambion Taq DNA聚合酶 TaKaRa  T7 转录试剂盒 Invitrogen T4 DNA裂连接 TaKaRa  胶回收试剂盒 Qiagen  质粒提取试剂盒 Axygen  Trizol试剂 Invitrogen  逆转录试剂盒 DNA提取试剂盒 Invitrogen  北京全式金生物科技有限公司 ISCA1（PA5-60121）抗体 Invitrogen GADPH Santa Cruz Biotechnology NC膜 Millipore 化学发光液 Immuno Cruz 蛋白质分子量标记物 Takara 蛋白酶抑制剂 罗氏 组织裂解液 Thermo 丽春红 Beyotime BCA试剂盒 Beyotime Western blot 洗液（10×） Beyotime 30%Acr-Bis Beyotime SDS-PAGE电泳液 Beyotime Western blot转膜液（粉剂） Beyotime TEMED Beyotime 过硫酸铵 Beyotime 1.5 M Tris·HCl（pH=8.8）缓冲液 Beyotime 1 M Tris·HCl（pH=6.8）缓冲液 Beyotime 琼脂 BD公司 异丙醇 北京化工厂 脱脂奶粉 内蒙古伊利实业集团股份有限公司   3.1.4模型构建流程 利用Cre/loxP重组系统的原理，进行条件性敲除（Conditional knockout，CKO），制备心肌组织特异性Isca1敲除大鼠。在Isca1基因第三外显子两端插入两个loxP位点来构建Isca1flox/+大鼠，使其与αMHC-Cre大鼠进行杂交，经两轮杂交最终获得Isca1flox/flox/MHC-Cre大鼠，并使用PCR方法进行基因型鉴定，使用Western blot技术进行敲除效率的鉴定。 3.1.5 Isca1条件性敲除大鼠及心肌组织特异性Isca1敲除大鼠的建立 3.1.5.1 Isca1条件性敲除大鼠模型的建立   设计方案     图 1. Isca1条件性敲除模型构建设计方案 构建sgRNA 载体pUC57-sgRNA expression vector，根据基因信息选择靶点并合成sgRNA。 靶点1: GCCTCCTGAGCAAGTGCT   GGG R-ISCA1-gRNA UP1        5’TAGGGCCTCCTGAGCAAGTGCT R-ISCA1-gRNA DOWN1    5’AAACAGCACTTGCTCAGGAGGC 靶点2: AGCCCTGAACTCCTTATG   TGG R-ISCA1-gRNA UP2        5’TAGGAGCCCTGAACTCCTTATG R-ISCA1-gRNA DOWN2    5’AAACCATAAGGAGTTCAGGGCT 合成的sgRNA单链通过退火复性结合成小片段，插入BSA I线性化的载体，构建完成的sgRNA载体通过体外转录成为可注射的sgRNA。 构建Cas9载体pST1374-NLS-flag-linker-Cas9，载体通过体外转录成为可注射的Cas9-RNA。 显微注射 超数排卵：15只3-4周龄SD雌鼠注射激素进行超排。 受精卵注射：取约150枚受精卵进行注射。 雄鼠结扎：制作30只8周龄输精管结扎的SD雄鼠。 受体鼠制备：8-10周龄SD雌鼠与结扎的SD雄鼠交配后选取见栓的雌鼠。 胚胎移植：将注射后的受精卵移植到受体鼠输卵管壶腹部（移植一次，150枚卵，5只受体鼠）。 基因型鉴定 剪尾编号：出生7-10天的乳鼠，剪取脚趾和尾尖进行编号及取材。 基因组DNA提取：使用基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA PCR检测：根据序列信息设计检测引物并进行PCR检测。 结果分析：选取通过PCR检测后含有不同于野生型分子量条带的鼠号，将PCR产物进行TA克隆，之后用检测引物进行菌液PCR，筛选有插入的克隆测序。 根据测序结果确定Isca1条件性敲除模型大鼠（SD. Isca1 (tm-loxp)-GC/ILAS，http://www.ratresource.com）用于后续实验。   3.1.5.2 心肌组织特异性Isca1敲除大鼠（Isca1flox/flox/MHC-Cre）的建立 根据3.1.5.1获得Isca1flox/+大鼠F1代后，首先通过8周龄左右Isca1flox/+与野生型大鼠进行杂交，获得一定数量的Isca1flox/+大鼠。与此同时使8周龄左右Isca1flox/+大鼠与αMHC-Cre大鼠（SD. Tg(MHC-CRE)-GC/ILAS，http://www.ratresource.com）进行杂交，得到Isca1flox/+/MHC-Cre大鼠。之后使8周龄左右Isca1flox/+大鼠与Isca1flox/+/MHC-Cre大鼠进行第二轮杂交，可得到Isca1flox/flox/MHC-Cre大鼠，即心肌组织特异性Isca1敲除纯合子大鼠，用于后续实验。 图 2. Isca1flox/flox/MHC-Cre大鼠的繁育   3.1.5.3 鼠尾基因组DNA提取 在幼崽出生后剪脚趾标记，收集幼崽脚趾至1.5 mL EP管。然后参照DNA提取试剂盒说明书按以下程序操作。 加入100 μL LB2和20 μL Proteinase K，55℃摇床孵育至完全裂解。 12000 rpm 离心5 min，转移上清于一无菌的离心管中。 加入500 μLBB2，立即涡旋5 s，室温孵育10 min。 将全部的溶液加入离心柱中，8000 rpm离心1 min，弃掉流出液。 加入500 μL CB2溶液，12000 rpm离心1 min，弃掉流出液。 重复步骤（5）一次。 加入500 μL WB2（使用前加入88 mL无水乙醇），12000 rpm 离心1 min，弃掉流出液。 重复步骤（7）一次。 10000 rpm 离心2 min，彻底去除残留的WB2。 将离心柱置于一干净的离心管中，开盖静置5 min，在柱的中央加入50~200 μL预热EB（60℃~70℃），盖上盖子，室温静置3 min，12000 rpm 离心2 min，洗脱DNA。保存至4℃冰箱。

　　肌萎缩侧索硬化（ALS）也叫运动神经元病（MND），后一名称英国常用，法国又叫夏科（Charcot）病，而美国也称卢伽雷（Lou Gehrig）病。我国通常将肌萎缩侧索硬化和运动神经元病混用。它是上运动神经元和下运动神经元损伤之后，导致包括球部（所谓球部，就是指的是延髓支配的这部分肌肉）、四肢、躯干、胸部腹部的肌肉逐渐无力和萎缩。患病率约为4-6/10万。大约10%的ALS病例是家族型的，90%是散发型的。 　　2018年5月11日，国家卫生健康委员会等5部门联合制定了《第一批罕见病目录》，肌萎缩侧索硬化被收录其中。

3.1 实验材料 3.1.1 实验动物 SD大鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司【SCXK（京）2012-001】。实验中涉及动物的操作程序已获得中国医学科学院医学实验动物研究所实验动物使用与管理委员会的批准，批准号为ZLF18003. 3.1.2实验仪器 仪器及耗材 生产厂商 NanoZoomer S60数字病理切片扫描仪 日本滨松光子学株式会社 Vevo770小动物超声影像系统 VisualSonics 激光共聚焦扫描显微镜 Leica 透射电子显微镜 JEOL 显微注射仪 Nikon 光学显微镜 Nikon 化学发光凝胶成像系统 BIO-RAD PCR仪 BIO-RAD 组织脱水机 Leica 石蜡切片机 Leica 石蜡包埋机 Leica 冰冻切片机 Leica 电泳仪 BIO-RAD 电泳槽 Tanon 数码凝胶图像处理系统 Tanon 组织匀浆机 POLYTRON 恒温培养箱 温控振荡箱 Incucell TAITEC 离心机 Eppendorf 摇床 SCILOGEX 塑料薄膜封口机 德清拜杰有限公司 电动鼓风干燥箱 天津市泰斯特仪器有限公司 电子称量器（量程0.5g-620g） 奥豪斯仪器（常州）有限公司 电子称量器（量程0.1mg-220g） Sartorius 4℃冰箱 海尔集团 -80℃冰箱 SANYO -20℃冰箱 SANYO 涡旋振荡器 上海沪西分析仪器厂 移液器 Eppendorf   3.1.3实验试剂 试剂 生产厂商 体外转录用试剂盒 Ambion Taq DNA聚合酶 TaKaRa T7 转录试剂盒 Invitrogen T4 DNA裂连接 TaKaRa 胶回收试剂盒 Qiagen 质粒提取试剂盒 Axygen Trizol试剂 Invitrogen 逆转录试剂盒 DNA提取试剂盒 Invitrogen 北京全式金生物科技有限公司 C9orf72（66140-1-lg）抗体 proteintech Purified Mouse Anti-GM130（610822）      BD Anti-Giantin antibody (ab37266) Abcam Anti-Rab5 antibody (ab18211) Abcam Anti-RAB7 antibody (ab137029 ) Abcam Anti-Rab11 antibody (ab3612) Abcam       Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 （A11029 ）  Invitrogen Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 （A21424 ） Invitrogen    Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 （A31572）  Invitrogene GADPH Santa Cruz Biotechnology NC膜 Millipore 化学发光液 Immuno Cruz 蛋白质分子量标记物 Takara 蛋白酶抑制剂 罗氏 组织裂解液 Thermo 丽春红 Beyotime BCA试剂盒 Beyotime Western blot 洗液（10×） Beyotime 30%Acr-Bis Beyotime SDS-PAGE电泳液 Beyotime Western blot转膜液（粉剂） Beyotime TEMED Beyotime 过硫酸铵 Beyotime 1.5 M Tris·HCl（pH=8.8）缓冲液 Beyotime 1 M Tris·HCl（pH=6.8）缓冲液 Beyotime 琼脂 BD公司 异丙醇 北京化工厂 脱脂奶粉 内蒙古伊利实业集团股份有限公司   3.1.4模型构建流程 设计方案 构建sgRNA 载体pUC57-sgRNA expression vector，根据基因信息选择靶点并合成sgRNA。 靶点1: agtcccacgaggaaacag    cgg 靶点2: aggcaaccagagcgctgg    cgg 合成的sgRNA单链通过退火复性结合成小片段，插入BSA I线性化的载体，构建完成的sgRNA载体通过体外转录成为可注射的sgRNA。 构建Cas9载体pST1374-NLS-flag-linker-Cas9，载体通过体外转录成为可注射的Cas9-RNA。 显微注射 超数排卵：15只3-4周龄SD雌鼠注射激素进行超排。 受精卵注射：取约150枚受精卵进行注射。 雄鼠结扎：制作30只8周龄输精管结扎的SD雄鼠。 受体鼠制备：8-10周龄SD雌鼠与结扎的SD雄鼠交配后选取见栓的雌鼠。 胚胎移植：将注射后的受精卵移植到受体鼠输卵管壶腹部（移植一次，150枚卵，5只受体鼠）。 基因型鉴定 剪尾编号：出生7-10天的乳鼠，剪取脚趾和尾尖进行编号及取材。 基因组DNA提取：使用基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA PCR检测：根据序列信息设计检测引物并进行PCR检测。 结果分析：选取通过PCR检测后含有不同于野生型分子量条带的鼠号，将PCR产物进行TA克隆，之后用检测引物进行菌液PCR，筛选有插入的克隆测序。 根据测序结果确定C9ORF72基HRE敲入模型大鼠（SD. C9ORF72 (tm)-GC/ILAS，http://www.ratresource.com）用于后续实验。

　　肌萎缩侧索硬化（ALS）也叫运动神经元病（MND），后一名称英国常用，法国又叫夏科（Charcot）病，而美国也称卢伽雷（Lou Gehrig）病。我国通常将肌萎缩侧索硬化和运动神经元病混用。它是上运动神经元和下运动神经元损伤之后，导致包括球部（所谓球部，就是指的是延髓支配的这部分肌肉）、四肢、躯干、胸部腹部的肌肉逐渐无力和萎缩。患病率约为4-6/10万。大约10%的ALS病例是家族型的，90%是散发型的。 　　2018年5月11日，国家卫生健康委员会等5部门联合制定了《第一批罕见病目录》，肌萎缩侧索硬化被收录其中。

3.1 实验材料 3.1.1 实验动物 SD大鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司【SCXK（京）2012-001】。实验中涉及动物的操作程序已获得中国医学科学院医学实验动物研究所实验动物使用与管理委员会的批准，批准号为ZLF18003. 3.1.2实验仪器 仪器及耗材 生产厂商 NanoZoomer S60数字病理切片扫描仪 日本滨松光子学株式会社 Vevo770小动物超声影像系统 VisualSonics 激光共聚焦扫描显微镜 Leica 透射电子显微镜 JEOL 显微注射仪 Nikon 光学显微镜 Nikon 化学发光凝胶成像系统 BIO-RAD PCR仪 BIO-RAD 组织脱水机 Leica 石蜡切片机 Leica 石蜡包埋机 Leica 冰冻切片机 Leica 电泳仪 BIO-RAD 电泳槽 Tanon 数码凝胶图像处理系统 Tanon 组织匀浆机 POLYTRON 恒温培养箱 温控振荡箱 Incucell TAITEC 离心机 Eppendorf 摇床 SCILOGEX 塑料薄膜封口机 德清拜杰有限公司 电动鼓风干燥箱 天津市泰斯特仪器有限公司 电子称量器（量程0.5g-620g） 奥豪斯仪器（常州）有限公司 电子称量器（量程0.1mg-220g） Sartorius 4℃冰箱 海尔集团 -80℃冰箱 SANYO -20℃冰箱 SANYO 涡旋振荡器 上海沪西分析仪器厂 移液器 Eppendorf   3.1.3实验试剂 试剂 生产厂商 体外转录用试剂盒 Ambion Taq DNA聚合酶 TaKaRa T7 转录试剂盒 Invitrogen T4 DNA裂连接 TaKaRa 胶回收试剂盒 Qiagen 质粒提取试剂盒 Axygen Trizol试剂 Invitrogen 逆转录试剂盒 DNA提取试剂盒 Invitrogen 北京全式金生物科技有限公司 C9orf72（66140-1-lg）抗体 proteintech Purified Mouse Anti-GM130（610822）      BD Anti-Giantin antibody (ab37266) Abcam Anti-Rab5 antibody (ab18211) Abcam Anti-RAB7 antibody (ab137029 ) Abcam Anti-Rab11 antibody (ab3612) Abcam       Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 （A11029 ）  Invitrogen Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 （A21424 ） Invitrogen    Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 （A31572）  Invitrogene GADPH Santa Cruz Biotechnology NC膜 Millipore 化学发光液 Immuno Cruz 蛋白质分子量标记物 Takara 蛋白酶抑制剂 罗氏 组织裂解液 Thermo 丽春红 Beyotime BCA试剂盒 Beyotime Western blot 洗液（10×） Beyotime 30%Acr-Bis Beyotime SDS-PAGE电泳液 Beyotime Western blot转膜液（粉剂） Beyotime TEMED Beyotime 过硫酸铵 Beyotime 1.5 M Tris·HCl（pH=8.8）缓冲液 Beyotime 1 M Tris·HCl（pH=6.8）缓冲液 Beyotime 琼脂 BD公司 异丙醇 北京化工厂 脱脂奶粉 内蒙古伊利实业集团股份有限公司   3.1.4模型构建流程 设计方案 构建sgRNA 载体pUC57-sgRNA expression vector，根据基因信息选择靶点并合成sgRNA。 靶点1: ccC   caccatctcctgctgttg 靶点2: aacggagatcggagcactta   cgg 合成的sgRNA单链通过退火复性结合成小片段，插入BSA I线性化的载体，构建完成的sgRNA载体通过体外转录成为可注射的sgRNA。 构建Cas9载体pST1374-NLS-flag-linker-Cas9，载体通过体外转录成为可注射的Cas9-RNA。 显微注射 超数排卵：15只3-4周龄SD雌鼠注射激素进行超排。 受精卵注射：取约150枚受精卵进行注射。 雄鼠结扎：制作30只8周龄输精管结扎的SD雄鼠。 受体鼠制备：8-10周龄SD雌鼠与结扎的SD雄鼠交配后选取见栓的雌鼠。 胚胎移植：将注射后的受精卵移植到受体鼠输卵管壶腹部（移植一次，150枚卵，5只受体鼠）。 基因型鉴定 剪尾编号：出生7-10天的乳鼠，剪取脚趾和尾尖进行编号及取材。 基因组DNA提取：使用基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA PCR检测：根据序列信息设计检测引物并进行PCR检测。 结果分析：选取通过PCR检测后含有不同于野生型分子量条带的鼠号，将PCR产物进行TA克隆，之后用检测引物进行菌液PCR，筛选有插入的克隆测序。 根据测序结果确定C9ORF72基因敲除模型大鼠（SD. C9ORF72 (tm)-GC/ILAS，http://www.ratresource.com）用于后续实验。

心律失常（arrhythmia）是由于窦房结激动异常或激动产生于窦房结以外，激动的传导缓慢、阻滞或经异常通道传导，即心脏活动的起源和（或）传导障碍导致心脏搏动的频率和（或）节律异常。心律失常是心血管疾病中重要的一组疾病。它可单独发病，亦可与其他心血管病伴发。其预后与心律失常的病因、诱因、演变趋势、是否导致严重血流动力障碍有关，可突然发作而致猝死，亦可持续累及心脏而致其衰竭。 遗传性心律失常多为基因通道突变所致，如长QT综合征、短QT综合征、Brugada综合征等。后天获得性心律失常可见于各种器质性心脏病，其中以冠状动脉粥样硬化性心脏病、心肌病、心肌炎和风湿性心脏病多见，尤其在发生心力衰竭或急性心肌梗死时。另有发生在基本健康者或植物神经功能失调患者中的心律失常。其他病因包括电解质或内分泌失调，麻醉，低温，胸腔或心脏手术，药物作用和中枢神经系统疾病等，部分病因不明。

包括实验材料（实验动物、试剂、仪器）、实验环境、细胞培养/载体构建//蛋白表达/病原培养鉴定方法、实验操作规程、动物处理伦理等内容。 3.1 实验材料 3.1.1 实验动物 SD大鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司【SCXK（京）2012-001】。实验中涉及动物的操作程序已获得中国医学科学院医学实验动物研究所实验动物使用与管理委员会的批准，批准号为ZLF18003. 3.1.2实验仪器 仪器及耗材 生产厂商 NanoZoomer S60数字病理切片扫描仪 日本滨松光子学株式会社 Vevo770小动物超声影像系统 VisualSonics 激光共聚焦扫描显微镜 Leica 透射电子显微镜 JEOL 显微注射仪 Nikon 光学显微镜 Nikon 化学发光凝胶成像系统 BIO-RAD PCR仪 BIO-RAD 组织脱水机 Leica 石蜡切片机 Leica 石蜡包埋机 Leica 冰冻切片机 Leica 电泳仪 BIO-RAD 电泳槽 Tanon 数码凝胶图像处理系统 Tanon 组织匀浆机 POLYTRON 恒温培养箱 温控振荡箱 Incucell TAITEC 离心机 Eppendorf 摇床 SCILOGEX 塑料薄膜封口机 德清拜杰有限公司 电动鼓风干燥箱 天津市泰斯特仪器有限公司 电子称量器（量程0.5g-620g） 奥豪斯仪器（常州）有限公司 电子称量器（量程0.1mg-220g） Sartorius 4℃冰箱 海尔集团 -80℃冰箱 SANYO -20℃冰箱 SANYO 涡旋振荡器 上海沪西分析仪器厂 移液器 Eppendorf   3.1.3实验试剂 试剂 生产厂商 体外转录用试剂盒 Ambion Taq DNA聚合酶 TaKaRa  T7 转录试剂盒 Invitrogen T4 DNA裂连接 TaKaRa  胶回收试剂盒 Qiagen  质粒提取试剂盒 Axygen  Trizol试剂 Invitrogen  逆转录试剂盒 DNA提取试剂盒 Invitrogen  北京全式金生物科技有限公司 Epha4（ab157588）抗体 Abcam GADPH Santa Cruz Biotechnology NC膜 Millipore 化学发光液 Immuno Cruz 蛋白质分子量标记物 Takara 蛋白酶抑制剂 罗氏 组织裂解液 Thermo 丽春红 Beyotime BCA试剂盒 Beyotime Western blot 洗液（10×） Beyotime 30%Acr-Bis Beyotime SDS-PAGE电泳液 Beyotime Western blot转膜液（粉剂） Beyotime TEMED Beyotime 过硫酸铵 Beyotime 1.5 M Tris·HCl（pH=8.8）缓冲液 Beyotime 1 M Tris·HCl（pH=6.8）缓冲液 Beyotime 琼脂 BD公司 异丙醇 北京化工厂 脱脂奶粉 内蒙古伊利实业集团股份有限公司   3.1.4模型构建流程 在Epha4基因的启动子后插入一个报告基因mCherry，造成移码突变，实现基因敲除，制备Epha4基因敲除大鼠，并使用PCR方法进行基因型鉴定，使用Western blot技术进行敲除效率的鉴定。 3.1.5 Epha4敲除大鼠的建立 3.1.5.1 Epha4敲除大鼠模型的建立 设计方案 图 1. Epha4敲除模型构建设计方案 构建sgRNA 载体pUC57-sgRNA expression vector，根据基因信息选择靶点并合成sgRNA。 靶点1: CCA   GCCTCCGGAGACCTTGAG R-EPHA4-gRNA UP1      5’TAGGCTCAAGGTCTCCGGAGGC R-EPHA4-gRNA DOWN1    5’AAACGCCTCCGGAGACCTTGAG 靶点2: CCC   GGCGAATGAAGGTAAGAG R-EPHA4-gRNA UP2      5’TAGGCTCTTACCTTCATTCGCC R-EPHA4-gRNA DOWN2    5’AAACGGCGAATGAAGGTAAGAG 合成的sgRNA单链通过退火复性结合成小片段，插入BSA I线性化的载体，构建完成的sgRNA载体通过体外转录成为可注射的sgRNA。 构建Cas9载体pST1374-NLS-flag-linker-Cas9，载体通过体外转录成为可注射的Cas9-RNA。 显微注射 超数排卵：15只3-4周龄SD雌鼠注射激素进行超排。 受精卵注射：取约150枚受精卵进行注射。 雄鼠结扎：制作30只8周龄输精管结扎的SD雄鼠。 受体鼠制备：8-10周龄SD雌鼠与结扎的SD雄鼠交配后选取见栓的雌鼠。 胚胎移植：将注射后的受精卵移植到受体鼠输卵管壶腹部（移植一次，150枚卵，5只受体鼠）。 基因型鉴定 剪尾编号：出生7-10天的乳鼠，剪取脚趾和尾尖进行编号及取材。 基因组DNA提取：使用基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA PCR检测：根据序列信息设计检测引物并进行PCR检测。 结果分析：选取通过PCR检测后含有不同于野生型分子量条带的鼠号，将PCR产物进行TA克隆，之后用检测引物进行菌液PCR，筛选有插入的克隆测序。 根据测序结果确定Epha4敲除模型大鼠（SD.Epha4(tm-mCherry)-GC/ILAS，http://www.ratresource.com）用于后续实验。   3.1.5.2 Epha4敲除大鼠的建立 根据3.1.5.1获得Epha4-/-大鼠F1代后，首先通过8周龄左右Epha4-/-与野生型大鼠进行杂交，获得一定数量的Epha4+/-大鼠。之后使8周龄左右Epha4+/-大鼠进行第二轮杂交，可得到Epha4-/-大鼠，用于后续实验。   3.1.5.3 鼠尾基因组DNA提取 在幼崽出生后剪脚趾标记，收集幼崽脚趾至1.5 mL EP管。然后参照DNA提取试剂盒说明书按以下程序操作。 加入100 μL LB2和20 μL Proteinase K，55℃摇床孵育至完全裂解。 12000 rpm 离心5 min，转移上清于一无菌的离心管中。 加入500 μLBB2，立即涡旋5 s，室温孵育10 min。 将全部的溶液加入离心柱中，8000 rpm离心1 min，弃掉流出液。 加入500 μL CB2溶液，12000 rpm离心1 min，弃掉流出液。 重复步骤（5）一次。 加入500 μL WB2（使用前加入88 mL无水乙醇），12000 rpm 离心1 min，弃掉流出液。 重复步骤（7）一次。 10000 rpm 离心2 min，彻底去除残留的WB2。 将离心柱置于一干净的离心管中，开盖静置5 min，在柱的中央加入50~200 μL预热EB（60℃~70℃），盖上盖子，室温静置3 min，12000 rpm 离心2 min，洗脱DNA。保存至4℃冰箱。

　　脱髓鞘疾病，是一类由遗传性遗传因素、病毒感染或自身免疫等因素造成神经纤维的髓鞘脱失造成的疾病，髓鞘的脱失会使神经冲动的传送受到影响，会导致肢体颤抖、运动共济失调、多发性硬化以及癫痫。病变部位主要在脊髓、小脑、脑干。 　　这类疾病主要表现为肢体无力、平感觉异常、进行性肢体协调运动障碍、眼部症状等，并可伴有复杂的神经系统损害，亦可伴大脑皮质功能损害如认知功能障碍和（或）精神行为异常等。病理特征主要表现为神经纤维髓鞘破坏，病灶呈多发性播散，分布于中枢神经的白质，沿小静脉周围炎症细胞浸润。神经细胞/轴突以及支持组织相对完成。该类疾病的发病高峰为二到三周，若治疗延误受损神经继发缺血变性则发生多发性硬化，发病严重时可侵犯脊髓前角细胞和脑干神经核以及大脑运动皮质锥体细胞危及生命。 　　该疾病的发病率较高，倾向于年轻人患病，中国预测枚10万人约有2人发病，我国人口基数较大，因此该类疾病仍是一个非常严峻的问题。发病机制总结如下图所示。 　　诊断方法包括（1）脑脊液（CSF）检查，IgG鞘内合成检测；（2）诱发电位检测，脱髓鞘病变使得神经传导速度减慢，潜伏期延长、拨付降低；（3）MRI检查。 　　药物治疗，主要是通过抑制炎性脱髓鞘病变进展，防止疾病其病变恶化，晚期对症支持疗法，减轻神经功能障碍带来的痛苦。治疗药物主要包括（1）皮质类固醇，如甲基泼尼松龙、泼尼松、IFN-β1a& IFN-β1b重组制剂、硫唑嘌呤、醋酸格拉太米尔等。

3.1 实验材料 3.1.1 实验动物 SD大鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司【SCXK（京）2012-001】。超排用雌鼠数量10-15只，年龄3周龄，交配传代用野生型SD大鼠为成年8-10周龄大鼠。实验中基因工程大鼠由本实验室繁殖产生。实验中涉及动物的操作程序已获得中国医学科学院医学实验动物研究所实验动物使用与管理委员会的批准，批准号为ZLF18003.    3.1.2实验仪器 仪器及耗材 生产厂商 NanoZoomer S60数字病理切片扫描仪 日本滨松光子学株式会社 激光共聚焦扫描显微镜 Leica 透射电子显微镜 JEOL 显微注射仪 Nikon 光学显微镜 Nikon 化学发光凝胶成像系统 BIO-RAD PCR仪 BIO-RAD Realtime PCR仪 ABI 冰冻切片机 Leica 电泳仪 BIO-RAD 电泳槽 Tanon 数码凝胶图像处理系统 Tanon 组织匀浆机 POLYTRON 恒温培养箱 温控振荡箱 Incucell TAITEC 离心机 Eppendorf 摇床 SCILOGEX 塑料薄膜封口机 德清拜杰有限公司 电动鼓风干燥箱 天津市泰斯特仪器有限公司 电子称量器（量程0.5g-620g） 奥豪斯仪器（常州）有限公司 电子称量器（量程0.1mg-220g） Sartorius 4℃冰箱 海尔集团 -80℃冰箱 SANYO -20℃冰箱 SANYO 涡旋振荡器 上海沪西分析仪器厂 移液器 Eppendorf MRI 西门子 PET/CT 西门子   3.1.3实验试剂 试剂 生产厂商 体外转录用试剂盒 Ambion Taq DNA聚合酶 TaKaRa  T7 转录试剂盒 Invitrogen T4 DNA裂连接 TaKaRa  胶回收试剂盒 Qiagen  质粒提取试剂盒 Axygen  Trizol试剂 Invitrogen  逆转录试剂盒 DNA提取试剂盒 Invitrogen  北京全式金生物科技有限公司 MBP（MAB42282）抗体 R&D GADPH Santa Cruz Biotechnology NC膜 Millipore 化学发光液 Immuno Cruz 蛋白质分子量标记物 Takara 蛋白酶抑制剂 罗氏 组织裂解液 Thermo 丽春红 Beyotime BCA试剂盒 Beyotime Western blot 洗液（10×） Beyotime 30%Acr-Bis Beyotime SDS-PAGE电泳液 Beyotime Western blot转膜液（粉剂） Beyotime TEMED Beyotime 过硫酸铵 Beyotime 1.5 M Tris·HCl（pH=8.8）缓冲液 Beyotime 1 M Tris·HCl（pH=6.8）缓冲液 Beyotime 琼脂 BD公司 异丙醇 北京化工厂 脱脂奶粉 内蒙古伊利实业集团股份有限公司   3.1.4模型构建流程 利用CRISPR/Cas9技术制备MBP敲除大鼠。在MBP基因起始密码子之前插入Cre重组酶，来构建MBP-Cre大鼠(SD.MBP(tm-Cre)-GC/ILAS)。该模型与Cre 报告大鼠进行杂交(SD.Rosa26(tm-imCherry)-GC/ILAS)，可以检测MBP基因的表达图谱，同时通过杂合子交配的方式可以获得该基因敲除的纯合子大鼠，使用PCR方法进行基因型鉴定，使用Western blot技术进行蛋白水平敲除效率的鉴定。 3.1.5 MBP-Cre大鼠的建立 3.1.5.1 MBP-Cre大鼠模型的建立 设计方案 图 1. MBP-Cre大鼠模型构建设计方案 构建sgRNA 载体pUC57-sgRNA expression vector，根据基因信息选择靶点并合成sgRNA。 靶点1: R-Mbp-EA-gRNAup: TAGGTGCCCACCCAGCTGACCC R- Mbp-EA-gRNAdown: AAACGGGTCAGCTGGGTGGGCA   GGCGCTTCTTTAGCGGTGAC  AGG R-Mbp-EB-gRNAup: TAGGCGCTTCTTTAGCGGTGAC R- Mbp-EB-gRNAdown: AAACGTCACCGCTAAAGAAGCG 合成的sgRNA单链通过退火复性结合成小片段，插入BSA I线性化的载体，构建完成的sgRNA载体通过体外转录成为可注射的sgRNA。 构建Cas9载体pST1374-NLS-flag-linker-Cas9，载体通过体外转录成为可注射的Cas9-RNA。 显微注射 超数排卵：10-15只3周龄SD雌鼠注射激素进行超排。 受精卵注射：取约120枚受精卵进行注射。 受体鼠制备：8-10周龄SD雌鼠与结扎的SD雄鼠交配后选取见栓的雌鼠。 胚胎移植：将注射后的受精卵移植到受体鼠输卵管壶腹部（移植一次，120枚卵，5只受体鼠）。 基因型鉴定 剪尾编号：出生7-10天的乳鼠，剪取脚趾和尾尖进行编号及取材。 基因组DNA提取：使用基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA PCR检测：根据序列信息设计检测引物并进行PCR检测。 结果分析：选取通过PCR检测后含有不同于野生型分子量条带的鼠号，将PCR产物进行TA克隆，之后用检测引物进行菌液PCR，筛选有插入的克隆测序。 根据测序结果确定MBP-Cre模型大鼠（SD.MBP(tm-Cre)-GC/ILAS，http://www.ratresource.com）用于后续实验。   3.1.5.2 动物繁殖和表达图谱分析 获得F0代后，首先通过与野生型大鼠进行杂交，进行基因修饰大鼠传代能力分析。该模型包含Cre重组酶，可以同时与Cre reporter大鼠（SD.Rosa26(tm-imCherry)-GC/ILAS，http://www.ratresource.com）进行杂交，得到imCherry/MHC-Cre大鼠，进行表达图谱分析。之后MBP-Cre大鼠通过杂合子与杂合子杂交，获得MBP-Cre纯合子大鼠，进行蛋白表达分析，并用于后续实验。 图 2. MBP-Cre大鼠的繁育   3.1.5.3 鼠尾基因组DNA提取 在幼崽出生后剪脚趾标记，收集幼崽脚趾至1.5 mL EP管。然后参照DNA提取试剂盒（全式金）说明书按以下程序操作。 加入100 μL LB2和20 μL Proteinase K，55℃摇床孵育至完全裂解。 12000 rpm 离心5 min，转移上清于一无菌的离心管中。 加入500 μLBB2，立即涡旋5 s，室温孵育10 min。 将全部的溶液加入离心柱中，8000 rpm离心1 min，弃掉流出液。 加入500 μL CB2溶液，12000 rpm离心1 min，弃掉流出液。 重复步骤（5）一次。 加入500 μL WB2（使用前加入88 mL无水乙醇），12000 rpm 离心1 min，弃掉流出液。 重复步骤（7）一次。 10000 rpm 离心2 min，彻底去除残留的WB2。 将离心柱置于一干净的离心管中，开盖静置5 min，在柱的中央加入50~200 μL预热EB（60℃~70℃），盖上盖子，室温静置3 min，12000 rpm 离心2 min，洗脱DNA。保存至4℃冰箱。

帕金森病（Parkinson’s disease，PD） 临床症状主要表现为震颤、肌强直、运动减少、姿势及步态不稳等。 病理表现主要为中脑部位黑质纹状体多巴胺能神经元损害和出现神经元胞浆Lewy小体。 发病机制主要包括9种学说，即基因因素，蛋白质错误折叠和聚集，氧化应激反应，神经毒性物质，线粒体缺损，小神经胶质细胞活性，营养因子缺损，基底核排出物过度活跃，细胞程序性死亡。

1、模型制作 主要设备：脑立体定位仪、微量注射器、微型手持式颅钻、气体麻醉机、棉签、手术器械（持针器、手术刀柄、眼科剪、眼科镊、无菌缝合针线） 主要试剂：6-OHDA、生理盐水、75%乙醇、阿扑吗啡 材料：200g雄性SD大鼠 手术流程： （1）将大鼠置于气体麻醉机诱导箱内麻醉平稳后，俯卧平头颅位固定于小动物脑立体定位仪上。 （2）75%酒精消毒手术部位，减去头部顶毛，再次酒精消毒。 （3）沿颅顶正中切开动物皮肤，将颅骨表面的结缔组织膜除净，使前、后囟暴露清晰，少量出血时可用无菌棉签压迫止血。 （4）用规格为10μL的微量注射器抽取5μL的6-OHDA工作液，垂直固定于脑立体定位仪上，参照Paxinos＆Watson大鼠脑立体定位图谱，选取大鼠单侧两点内侧前脑束（MFB）的注射坐标与体积为：①TB=-2.3mm，L=+1.2mm,AP=-4.4mm，DV=-8.2mm，2.5μL（7.5μg）；②TB=+3.4mm，L=+0.8mm,AP=-4.0mm，DV=-8.4mm，2.0μL（6μg）。将前囟作为标准参考点，读取并标记注射靶点。 （5）于标记处使用钻头钻开颅骨，微量注射器沿钻孔垂直进针，向注射靶点内推注6-OHDA工作液，推注速度0.5μL/min，进出针速度1mm/min，留针5min。 （6）消毒伤口，缝合皮肤，将动物置于安静保温处，清醒后自由进食饮水。

帕金森病（Parkinson’s disease，PD） 临床症状主要表现为震颤、肌强直、运动减少、姿势及步态不稳等。 病理表现主要为中脑部位黑质纹状体多巴胺能神经元损害和出现神经元胞浆Lewy小体。 发病机制主要包括9种学说，即基因因素，蛋白质错误折叠和聚集，氧化应激反应，神经毒性物质，线粒体缺损，小神经胶质细胞活性，营养因子缺损，基底核排出物过度活跃，细胞程序性死亡。

1、模型制作 通过立体定位注射将6-OHDA（6µg/µl）打到小鼠纹状体脑区，参考坐标AP: +0.3; L: +2.3, DV:-2.9。