| 标识符 | CSTR:16397.09.0G01001033 |
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| 资源中文名称 | PON1基因敲除大鼠 |
| 资源英文名称 | PON1 knockout SD rat |
| 疾病概述 | 我们的模型研究结果证实PON1敲除损伤免疫T细胞的发育，并显著调节神经免疫细胞——小胶质细胞的极化，之前的文献报道揭示了PON1参与抑制单核-巨噬细胞的分化，均提示PON1可作为一种新的免疫调节因子。该动物模型涉及到小胶质细胞相关的炎症反应和T细胞发育两方面，分述如下： 小胶质细胞是脑内常驻的免疫细胞，数量约占人脑细胞总数的0.5-16.6%，又称脑内的巨噬细胞，构成中枢神经系统的第一道防线。生理状态下的小胶质细胞处于相对的静息状态，因此被称为静息型小胶质细胞 (resting microglia)。静 息型小胶质细胞在发育的神经系统中起着调控神经元存活和修饰突触的作用，并且在成熟的健康脑中具有探测和调控神经元活动的功能；在炎症刺激病理状态下，包括在脑损伤、病原入侵以及退行性疾病中，小胶质细胞首先启动，迁移至损伤部位，转化为激活状态，呈现阿米巴虫样的典型巨噬细胞形态，因此被称为阿米巴样小胶质细胞(amoebic microglia)。小胶质细胞激活大体分为M1经典激活型和M2选择激活型。M1型为促炎状态，小胶质细胞释放大量的促炎性细胞因子如肿瘤坏死因子α、白介素1β、白介素6或白介素12，这些炎性因子会对神经细胞产生毒性作用, 严重的会致使神经细胞凋亡；M2型为抗炎状态，能够释放抗炎性细胞因子如白介素4、白介素13，吞噬损伤的神经细胞碎片、促进组织修复和神经元的再生。 神经炎症反应是许多神经退行性病变的重要病理基础，在神经系统创伤后的神经退变中也发挥重要作用。小胶质细胞通过吞噬作用清除细胞碎片，并释放神经生长及抗炎因子而减轻神经损伤，促进组织修复。然而很明显，小胶质细胞高度活化状态可释放高水平的促炎因子及细胞毒性物质，从而造成神经元失能及细胞死亡。神经系统损伤后，活化的小胶质细胞及浸润的巨噬细胞具有异质性。 胸腺是机体的重要免疫器官，由皮质和髓质两部分组成，主要包括胸腺上皮细胞和T淋巴细胞。T淋巴细胞(T细胞)是淋巴细胞的一种,在免疫反应中扮演着重要的角色。T细胞在胸腺中发育经历CD4-CD8-(Double negative,DN)、CD4+ CD8+(Double positive,DP)及CD4+或CD8+(Single positive,SP)三个主要阶段,最后进入外周淋巴组织。胸腺病变将对机体免疫功能带来严重影响，使机体免疫自稳功能紊乱并伴发自身免疫性疾病。但是，目前对于胸腺发育和T淋巴细胞产生的分子机制仍不清楚。 |
| 实验动物背景信息 | SD大鼠 |
| 模型制作方法 | 1. 实验材料 1.1实验动物 SD大鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司和北京华阜康生物科技股份有限公司。 1.2主要实验仪器 Nikon显微注射仪 Nikon光学显微镜 BIO-RAD电泳仪 Tanon电泳槽 Tanon数码凝胶图像处理系统 Incucell恒温培养箱温控 TAITEC振荡箱 Eppendorf 离心机 Eppendorf 移液器 2.实验操作规程和动物处理伦理 模型制作中涉及动物的操作程序已获得中国医学科学院医学实验动物研究所实验动物使用与管理委员会的批准，批准号为ZLF18003，简要步骤如下： 2.1 供卵雌鼠超排 实验第一天8：00 腹腔注射PMSG 30IU/只(0.6ml／只)，46～48h以后，实验第三天10：00 腹腔注射HCG 30IU/只(0.6ml／只)，注射HCG后立即与与种鼠1：1合笼。实验第四天8：00～9：00检查阴道栓，有阴道栓的大鼠在大鼠标牌上注明日期和⊕（阳性），捡出有阴栓的大鼠进行受精卵的收集。 2.2受精卵的收集 2%戊巴比妥钠麻醉大鼠，脱颈处死，解剖大鼠，找到卵巢，输卵管和子宫，将卵取出，用透明质酸酶消除胚泡的黏着，使卵分离。在移换到另外的培养液中，要将透明质酸酶充分洗净（洗约3~5次）。 2.3 向受精卵雄性原核注入DNA溶液 2.4. 仅将未损坏的完成操作的卵收集起来，移植到假妊娠大鼠输卵管中。术后将大鼠置于安静的环境下饲养。 2.5 基因表型鉴定 在判定有导入基因大鼠之后，立即将基因修饰大鼠另行饲养，对不用的大鼠进行处理。阴性大鼠的处理：（1）留和阳性大鼠等量的阴性大鼠对照。（2）剩余的阴性大鼠用于其它符合动物伦理的其他实验室的实验（保存记录）。 3. PON1基因敲除靶点设计与测序鉴定 利用CRISPR/Cas9 技术建立基因敲除大鼠，sgRNA 的作用靶点位于第四外显子。通过显微注射成功获得敲除大鼠，其中首建鼠F0（#20）敲除片段大小为342bp，能够稳定传代。PON1 杂合子大鼠之间杂交得到同窝阴性对照大鼠和敲除纯合子用于实验研究。大鼠模型资源详见（SD.Pon1(tm)-GC/ILAS，http://www.ratresource.com）
图1 PON1基因敲除设计策略 |
| 模型表型数据 |
图2 PON1在脑和小胶质细胞中的蛋白表达水平鉴定
图3 PON1在脾和胸腺免疫器官中的蛋白表达水平鉴定
图4 PON1敲除大鼠和野生型大鼠LPS实验中的生存率分析
图5 PON1敲除大鼠和野生型大鼠LPS实验血清的ELISA分析
图6 PON1敲除大鼠和野生型大鼠神经小胶质细胞免疫组化分析
5.1 PON1敲除大鼠小胶质细胞吞噬功能增强
图7 PON1对小胶质细胞吞噬功能的调节 5.2 PON1 敲除降低LPS诱导的促炎性细胞因子分泌
图8 利用Luminex 和ELISA方法检测细胞上清中细胞因子的分泌水平。
图9 PON1敲除大鼠和野生型大鼠胸腺细胞对比分析 |
| 动物模型的评价与验证 | |
| 保存方式 | 活体繁殖 |
| 合作方式 | |
| 相关文章 | |
| 备注 |
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