C57BL/6J小鼠

包括实验材料（实验动物、试剂、仪器）、实验环境、细胞培养/载体构建/蛋白表达/病原培养鉴定方法、实验操作规程、动物处理伦理等内容。

（一）GPR68 Ko小鼠的构建

1、实验设计

根据GPR68蛋白保守区和基因组结构，设计需要删除的外显子。GPR68基因存在多种转录产物，但根据GPR68基因组结构和蛋白功能保守区，只有一个蛋白编码区exon1。因此在exon1的两边设计gRNA靶点，将exon1进行全身性敲除。

图2 插入位点设计

2、Cas9/gRNA的活性检测

采用北京唯尚立德Cas9/gRNA靶点效率检测试剂盒检测gRNA靶点体外酶切活性。选体外活性高的gRNA显微注射受精卵，取胚胎检测內源活性。根据Cas9/gRNA的內源活性结果，选用活性较高的gRNA进行后续实验。

3、基因敲除小鼠的建立和和品系交配

选取活性高的CRISPR体外转录成RNA，显微注射到小鼠受精卵中，得到发生基因突变的首建者小鼠（founder）。对小鼠进行基因型鉴定，获得发生期望突变的founder小鼠。通过基因组DNA的PCR进行基因型的鉴定，若发生DNA片段删除，将出现特异的缩短的PCR产物。

4、稳定遗传的Gpr68敲除小鼠品系的建立

将带有突变的founder小鼠与野生型小鼠交配，得到基因突变的杂合子小鼠（+/-）F1代，并进行DNA测序，确认目标基因发生的DNA片段删除，从而目标蛋白被失活，实现基因敲除。

基因型相同的杂合子小鼠（+/-）相互交配，得到基因敲除的纯合子小鼠（-/-）F2代。大约有1/4几率的F2后代小鼠是基因敲除的纯合体小鼠。

（二）皮下移植黑色素瘤模型的构建

1、用0.25%胰酶消化细胞收集细胞悬液，用预冷的PBS重悬细胞，1000rpm离心5min，洗涤细胞两次，除去单细胞悬液中的血清。

2、对细胞进行计数，用PBS稀释细胞至浓度为2.5×10⁶个/mL，接种体积控制在0.2mL。

3、采用1mL无菌注射器于小鼠腋下部位接种细胞。接种时将单细胞悬液充分混匀，防止细胞成团导致活性降低以及接种细胞数不均，左手固定小鼠，右手执注射器，针头在皮下穿行时避免刺破皮肤与肌肉，到达接种位点并注射完毕后退出针头时避免细胞悬液溢出。

4、每3天用游标卡尺测量肿瘤大小，测量肿瘤最长和最短直径。肿瘤体积计算公式为V=a×b²/2(a为长轴，b为短轴)。

5、接种后第20天实验结束，采用颈椎脱臼法处死小鼠，解剖取出肿瘤组织，称量小鼠肿瘤重量、脾脏重量。

在无特殊刺激的情况下，GPR68-/-小鼠没有明显表型，且外观与同背景WT小鼠无明显差异。分别从DNA、mRNA、蛋白水平检测GPR68-/-小鼠组织中GPR68表达，如图3所示，在此三个水平上均不能检测到GPR68。

图3 鉴定GPR68-/-小鼠组织中GPR68的表达

a.鼠尾DNA的鉴定；b.脾脏T细胞的mRNA鉴定；c.脾脏T细胞的蛋白鉴定

分别对WT与GPR68-/-小鼠进行皮下注射接种5×10⁵个B16细胞，观察并检测肿瘤生长情况。接种后第20天，采用颈椎脱臼法处死小鼠，称量小鼠肿瘤重量、脾脏重量。如图4所示，与WT小鼠比较，GPR68-/-小鼠能够明显抑制黑色素瘤的发展，GPR68-/-小鼠脾脏增大，但二者体重无明显差异.

图4 GPR68敲除对黑色素瘤生长的抑制作用