在正常的免疫过程中，T细胞的有效激活是其能发挥免疫效应的前提及保证，若T细胞的活化不完全或者处于免疫应答无能状态时，则不能发挥杀灭肿瘤细胞的作用。T细胞的活化需要双信号同时刺激，即第一信号和第二信号的协同作用。第一信号来自于APC细胞表面的抗原肽-MHC复合物和T细胞表面的相对应受体相结合所传导，第二信号来自于APC细胞表面的共刺激分子与T细胞表面的相对应受体相结合所传导。 目前已经知道的最主要的共刺激分子是B7-1和B7-2，他们所对应T细胞表面受体为CD28，他们结合传递的是刺激性第二信号，和第一信号协同刺激T细胞的活化。近年来的研究发现，CTLA4与CD28会竞争性的与B7蛋白家族相结合，并且CTLA4与B7蛋白结合的亲和力是CD28的二十多倍，他们结合后在免疫反应的前期阶段传递抑制性信号，导致T细胞的活化受到抑制。免疫检验点CTLA4相当于是机体进化出来的刹车机制，它在维持免疫内稳态及防止免疫系统用力过猛之间发挥着重要作用，肿瘤细胞可以通过激活CTLA4信号通路从而躲避机体的抗肿瘤免疫效应。

3.1 实验材料 3.1.1 实验动物 本实验使用SPF级C57BL及ICR小鼠，购买于北京维通利华实验动物有限公司【SCXK（京）2012-001】并在本所SPF级动物屏障环境动物房[SYXK(京)2015-0035]中长期饲养繁殖。涉及动物操作程序和动物实验经本所动物使用与管理委员会（IACUC）批准，批准号为BL18003。 3.1.2实验仪器 仪器及耗材 生产厂商 NanoZoomer S60数字病理切片扫描仪 日本滨松光子学株式会社 透射电子显微镜 JEOL 显微注射仪 Nikon 光学显微镜 Nikon 化学发光凝胶成像系统 BIO-RAD PCR仪 BIO-RAD 电泳仪 BIO-RAD 电泳槽 Tanon 数码凝胶图像处理系统 Tanon 恒温培养箱 温控振荡箱 Incucell TAITEC 离心机 Eppendorf 摇床 SCILOGEX 塑料薄膜封口机 德清拜杰有限公司 电动鼓风干燥箱 天津市泰斯特仪器有限公司 电子称量器（量程0.5g-620g） 奥豪斯仪器（常州）有限公司 电子称量器（量程0.1mg-220g） Sartorius 4℃冰箱 海尔集团 -80℃冰箱 SANYO -20℃冰箱 SANYO 涡旋振荡器 上海沪西分析仪器厂 移液器 Eppendorf MRI 西门子 PET/CT 西门子   3.1.3实验试剂 试剂 生产厂商 体外转录用试剂盒 Ambion Taq DNA聚合酶 TaKaRa  T7 转录试剂盒 Invitrogen T4 DNA裂连接 TaKaRa  胶回收试剂盒 Qiagen  质粒提取试剂盒 Axygen  Trizol试剂 Invitrogen  逆转录试剂盒 DNA提取试剂盒 Invitrogen  北京全式金生物科技有限公司 MBP（MAB42282）抗体 R&D GADPH Santa Cruz Biotechnology NC膜 Millipore 化学发光液 Immuno Cruz 蛋白质分子量标记物 Takara 蛋白酶抑制剂 罗氏 组织裂解液 Thermo 丽春红 碧云天 BCA试剂盒 碧云天 Western blot 洗液（10×） 碧云天 30%Acr-Bis 碧云天 SDS-PAGE电泳液 碧云天 Western blot转膜液（粉剂） 碧云天 TEMED 碧云天 过硫酸铵 碧云天 1.5 M Tris·HCl（pH=8.8）缓冲液 碧云天 1 M Tris·HCl（pH=6.8）缓冲液 碧云天 琼脂 BD公司 异丙醇 北京化工厂 脱脂奶粉 内蒙古伊利实业集团股份有限公司   3.1.4模型构建流程 利用CRISPR /Cas9 技术，建立CTLA4基因人源化小鼠模型，利用PCR、RT-PCR和Western Blot 的方法进行鉴定及分析。 3.1.5 CTLA4人源化小鼠的建立 3.1.5.1 CTLA4人源化小鼠模型的建立 （1）设计方案 一、载体构建 1，sgRNA 载体 载体名称：pUC57-sgRNA expression vector Addgene ID: 51132 根据基因信息选择靶点，合成sgRNA（上海英潍捷基） targeting site 1: gggttcaaacacatctca    agg m-ctla4-gRNA up1      5’TAGGgggttcaaacacatctca m-ctla4-gRNA down1    5’aaacTGAGATGTGTTTGAACCC targeting site 2: gagacttctggaacatgg    aGg m-ctla4-gRNA up2      5’TAGGgagacttctggaacatgg m-ctla4-gRNA down2    5’aaacCCATGTTCCAGAAGTCTC 合成的sgRNA单链通过退火复性结合成小片段，插入BSAⅠ线性化的载体 sgRNA插入位点示意图 图1 CTLA4人源化小鼠模型构建设计方案 构建完成的sgRNA载体通过体外转录成为可注射的sgRNA。（体外转录用试剂盒：Ambion  Am1354） 2，CAS9 载体 载体名称：pST1374-NLS-flag-linker-Cas9 Addgene ID: 44758 载体通过体外转录成为可注射的Cas9-RNA（体外转录用试剂盒：Ambion  Am1345） 显微注射 1，超数排卵：15只3-4周龄c57雌鼠注射激素进行超排。 2，受精卵注射：取约150枚受精卵进行注射。 3，雄鼠结扎：制作30只8周龄输精管结扎的c57雄鼠。 4，受体鼠制备：8-10周龄ICR雌鼠与结扎的ICR雄鼠交配后选取见栓的雌鼠。 5，胚胎移植：将注射后的受精卵移植到受体鼠输卵管壶腹部（移植一次， 120枚卵，4只受体鼠）。 基因型鉴定 1，剪尾编号：出生7-10天的乳鼠，剪取脚趾和尾尖进行编号及取材。 2，基因组DNA提取： 使用全式金（Transgen）公司的基因组DNA提取试剂盒（EE101-12）提取基因组DNA 3，PCR检测：根据序列信息设计检测引物（上海英潍捷基） M-CTLA4-Ki-S1    5’CTACCACTGAGCTACATCTATACCTCTGAG    M-CTLA4-Ki-A1    5’GCCACGTGCATTGCTTTG   M-CTLA4-Ki-S2    5’GGAACCCAGATTTATGTAATTGATCC     M-CTLA4-Ki-A2    5’TTATTGGATAGTCAGCTGGTGTGC       M-CTLA4-KO-S    5’AGAAATTATACTCTCCAAGACTCCACG     M-CTLA4-KO-A    5’CCTTAAGTCCCAGCTGAGATCC      KI: TM=62℃      上游目的片段（S1-A1）： 1101bp               下游目的片段（S2-A2）： 1254bp KO： TM=62℃       WT：727bp    ko: (见测序分析) PCR反应体系及扩增程序（TaKaRa RR042A） 反应体系： 10×LA PCR BufferⅡ(Mg2+ Plus) 2.0 μl dNTP Mixture(2.5 μM) 1.6 μl 引物-S（50 μM ） 0.2 μl 引物-A（50 μM ） 0.2 μl 模板DNA 2.0 μl LA Taq 0.2 μl 补加ddH2O至总体积 20.0 μl 扩增程序： 95℃ 15 min； 95℃,       30 s TM-2℃,      30 s 72℃,       2 min 30循环； 72℃ min； 6×loading buffer 终止反应。 用1%的琼脂糖凝胶进行电泳。 4，结果分析： 选取PCR检测分子量不同于野生型条带的 (下图中箭头所示)，将PCR产物进行TA克隆，之后用检测引物进行菌液PCR，筛选有插入的克隆测序。    1-23#基因组PCR结果图（TaKaRa marker DL2000）（上游PCR结果）     1-23#基因组PCR结果图（TaKaRa marker DL2000）（下游PCR结果） 5，测序结果： KI：3#，5#，9#，14#，23# 黄色绿色为检测引物，蓝色字体为同源序列，红色为H-CTLA4基因ORF，灰色为BGH poly A ctaccactgagctacatctatacctctgagctgtgtcttcattgctgaggtatatgaactacgtctctatcactgagctgtgcctccaagttttaagtttctacctttgaaaatttttactattttttttaaaagcccatcctcctgtggaggttttaaatgtcttttcatttggattgactttctctgggccatccacaactttattttgccgttgttacagttttaaaagcatctggtttatttcccaacggacaaaaccagaggcccctttccctgttttgtgtgtgtgtgtttgtgtgtgcatatgtgtgcatgcatgtgcatgtacaaatgtgtgtgtgtctttcatttcttgtgattttggcatttttctctcagtaaaatactaagtggagttaggcaaaaataaacccttttgtgtactgaggggctcatagaaggacacaatttttcttggtgccttccaaagagaaattcagacatcagctccaggactaagagggatggccatgggacgctaagtaagagtactgggggattaaagatgaccagatgactggataaagttgggactgggatttagggattccttgtactacagaaattatactctccaagactccacgtctccaggtcctcagaggtgactcgaagcttcagtttcaagttgagtacattttccatccatggatttgcttgttttgttcagttttagtttgaatatttgaggtcgtctttacgacgtaacagctaaacccacggcttcctttctcgtaaaaccaaaacaaaaaggctctctgttcaggtgtcctgtgtgtgcactacacatatgtagcacgtaccttggatcaaagctgtctatataaagtccccgagtctgtgtgggttcaaacacatctcaaAgcttctggatcctgttgggttttactctgctccctgaggacctcagcacatttgccccccagccgccaccatggcttgccttggatttcagcggcacaaggctcagctgaacctggctaccaggacctggccctgcactctcctgttttttcttctcttcatccctgtcttctgcaaagcaatgcacgtggcccagcctgctgtggtactggccagcagccgaggcatcgccagctttgtgtgtgagtatgcatctccaggcaaagccactgaggtccgggtgacagtgcttcggcaggctgacagccaggtgactgaagtctgtgcggcaacctacatgatggggaatgagttgaccttcctagatgattccatctgcacgggcacctccagtggaaatcaagtgaacctcactatccaaggactgagggccatggacacgggactctacatctgcaaggtggagctcatgtacccaccgccatactacctgggcataggcaacggaacccagatttatgtaattgatccagaaccgtgcccagattctgacttcctcctctggatccttgcagcagttagttcggggttgtttttttatagctttctcctcacagctgtttctttgagcaaaatgctaaagaaaagaagccctcttacaacaggggtctatgtgaaaatgcccccaacagagccagaatgtgaaaagcaatttcagccttattttattcccatcaattgaCCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCtggaggaggtgtttttcctacatgggtttcgttttttttttttctttcagaagctgaggacagtgatttatagaaatgccagaagttaaagccaaaccctctactttttggtttaacagcttcctacagacaagttccaagaagaatataggaggtctagcagtagcgaaggagctgagactagccacagcagcttgctgggatctcagctgggacttaaggaaccatgagagttccttaagtcccatatgggggagaacaagttctttgtcactgctagaaaatcctgtaaagttaagagatttaaggggggcatttgaaatcgtgagtacatttgatcttgatatcacagtaacattaaggtttttctccttacccccaatcccacccccaaaacttacctaaattcaaataaataagaagttttcctcattcactttaagattttgagacactcttagttctttaaattatcacacctaaggcttaggggacatagcagaagagggggcagaaagactatgagagccaaaggtacatagagtttactgagagattgtgtctcttaggatgtcaaatggtacacccataaagtctcaccaacacgactgcctaaacttgagctgaataaggacatgaataacaatagacatacccaagtggatggggaaagaccaagatgcttcagcactatagcaataactacaggaagccaaggaatatggagagtaggaaattgccaagggaaaagcacaccagctgactatccaataa   3.1.5.2 动物繁殖和表达图谱分析 获得F0代后，首先通过与野生型C57小鼠进行杂交，进行基因修饰小鼠传代能力分析。之后CTLA4人源化小鼠通过杂合子与杂合子杂交，获得CTLA4人源化小鼠纯合子小鼠，进行蛋白表达分析，并用于后续实验。 3.1.5.3 鼠尾基因组DNA鉴定 在幼崽出生后剪脚趾标记，并剪尾至1.5 mL EP管。然后参照鼠尾直接PCR试剂盒（bimake）说明书按以下程序操作。 1.1. 按小鼠数量配制组织消化液，试剂比例如下：   （单样本） Protease Plus 2 μL Buffer L 100 μL 组织消化液现用现配，充分混匀后使用。 1.2. 向每个含有样本的EP管中加入100 μL新鲜组织消化液，55℃水浴/金属浴中消化15 min。组织消化时，务必将组织完全浸没于消化液中。消化完成后，组织外观上仍然完整，但足量的基因组DNA已经释放，不影响后续的PCR实验。 1.3. 将样本置于95℃水浴/金属浴中孵育5 min以灭活消化液中的蛋白酶活性。12000 rpm离心5分钟，取上清作为PCR模板。消化后的上清或连同组织的消化液可于-20℃保存三个月。 2. PCR扩增 2.1. PCR反应体系： PCR 反应组分 20 μL 反应体系 (μL) 50 μL 反应体系 (μL) ddH2O 8 21 正向引物 (10 μM) 0.5 1 反向引物 (10 μM) 0.5 1 模板（消化产物） 1 2 2 x M-PCR OPTI™ Mix 10 25 注：模板体积可以适当调整。 2.2. PCR反应条件： 温度 (℃) 时间 循环数 94 5 min 1 94 20 sec 35 60 30 sec 72 X min (2kb/min) 72 5 min 1 12 -- 1 3. 琼脂糖凝胶电泳 试剂2 x M-PCR OPTITM Mix中含有溴酚蓝染料，PCR产物可直接点样进行琼脂糖凝胶电泳。

高血压是一种由环境因素、遗传因素和行为因素相互作用产生的复杂心血 管症状，其中高盐摄入是最重要的环境因素之一。所谓血压的盐敏感性是指相 对高盐摄入所引起的血压升高，它带来的危害不仅仅是升高血压，还能够引发 脑卒中、心衰、动脉粥样硬化等并发症，并可加重胰岛素抵抗等。研究表明， 盐敏感性高血压病人并发心脑血管事件的风险远远高于盐耐受性高血压病人 [2]。西方发达国家一般人群中血压盐敏感者约 26%，而原发性高血压群体中血 压盐敏感者约 51%；我国一般人群中血压盐敏感者 20%-30%，而原发性高血 压群体中血压盐敏感者占 50-60%。因此，有效控制盐敏感性高血压对于改善 我国人群健康具有重要的意义。 盐敏感性高血压的病理机制表现为钠离子吸收增多或者肾脏重吸收异常导 致钠水潴留。目前抗高血压药物主要通过舒张血管和利尿改善钠水代谢的机制 降低机体血压，并且利尿药物作为临床用药的首选药物，但仍有一定比例的患 者没能达到控制目标。机体钠代谢的调节包括机体通过消化系统对钠的吸收和 通过肾脏对钠的排出，目前高血压治疗的临床药物和对高血压与钠水代谢的研 究主要集中在肾脏对钠水代谢的调节，而通过消化系统抑制机体钠的吸收可能 是从根本上解决盐敏感性高血压的重要手段。本动物模型将在前期研究结果的基础上，探索胃泌素抑制肠道对钠的吸收，及其在调节钠水代谢及盐敏感性高血压 中的重要作用，为盐敏感高血压的防治提供可靠的新模型和行之有效的新思路。

一、模型设计原理： GRNA介导Cas9蛋白剪切目标外显子两端的内含子DNA，同时提供同源模板Donor，基因组两端通过同源重组修复方式进行DNA修复，在特定外显子两端插入FloxP。CCKBR-FloxP小鼠与组织特异性表达Cre小鼠交配，从而实现CCKBR基因条件性敲除的目的。实验采用最新的spCas91.1进行注射，减少了基因组中的off-Target。 根据CCKBR基因组结构和蛋白功能保守区分析在Exon1的两边定点插入FloxP位点，实现将Exon1条件性敲除。 二、模型设计过程： 1)CCKBR基因GRNA靶点设计及活性检测 在要删除的Exon1外显子两端，设计gRNA靶点如下： Cckbr-L1: GCTTAGTTGGAGCTGAGTGGG Cckbr-L2: TGCTGGAGCTAGCTTAGTTGG Cckbr-L3: AGCAGGTGGAACCGGTGCTGG Cckbr-L4: CGCGGGAGCAGGTGGAACCGG Cckbr-R1: GGACCTAGGTGGGAGCTGAGG Reverse Complement: CCTCAGCTCCCACCTAGGTCC Cckbr-R2: GAGGGGAGGGACCTAGGTGGG Reverse Complement: CCCACCTAGGTCCCTCCCCTC Cckbr-R3: TTGGAGTCAGGAGAGCTTGGG Reverse Complement: CCCAAGCTCTCCTGACTCCAA Cckbr-R4: TGTGAAGGTGTTGGAGTCAGG Reverse Complement: CCTGACTCCAACACCTTCACA   使用Cas9/gRNA靶点效率检测试剂盒（货号：VK007）进行gRNA体外活性检测，结果如下： gRNA靶点活性检测结果分析如下：   2）CCKBRflox/flox,villin Cre小鼠设计     3）CCKBRflox/flox,villin Cre小鼠模型的繁育及鉴定结果： CCKBRfloxp/flox小鼠与Cre 的小鼠（villin Cre）杂交，对后代自交获得的小鼠进行基因型鉴定，成功获得CCKBR肠道上皮细胞条件性基因敲除小鼠CCKBRflox/flox,villin Cre）。见下图   经鉴定12#: CCKBRflox/flox,villin Cre

主动脉瘤(aortic  aneurysm) 指主动脉壁局部或弥漫性的异常扩张超过正常值 50%以上，压迫周围器官而引起症状，常发生在升主动脉主动脉弓、胸部降主动脉、胸腹主动脉和腹主动脉，其发病率在老年人群中可以高达5-10%，并呈上升趋势。主动脉瘤可由多种因素引起，如家族遗传、高血压、动脉硬化等，其主要病理改变为血管壁弹力纤维断裂及平滑肌细胞病变和血管外膜胶原沉积。 由于主动脉瘤是一种慢性血管炎症性疾病，近年来可以诱发血管炎症的多种因素与该疾病的发生机制研究一直被人们关注，包括盐皮质激素、血管紧张素II等，其中醋酸脱氧皮质酮（DOCA）是一种类固醇激素，可以与体内的盐皮质激素受体结合，影响机体内钠水代谢，进而诱发慢性炎症反应。有研究表明高盐加醋酸脱氧皮质酮（DOCA）缓释刺激可以通过激发血管的炎症反应而诱发小鼠动脉瘤的发生，并且该影响与年龄因素密切相关。本研究通过高盐加DOCA的方法建立小鼠血管瘤模型，并观察影响该疾病的相关通路因子，通过体内外实验增加或降低关键通路因子，进一步探索该疾病的病理生理发生机制，为该疾病的预防治疗提供新方法和思路。

1 实验材料 实验动物  选择健康雄性C57小鼠小鼠，体质量18-22 g，均购于北京华阜康华生物科技股份有限公司。饲养于中国医学科学院实验动物研究所动物中心动物房内，5只/盒屏障系统中，温度( 22±2) ℃，湿度50%～60%，12 h 循环照明，小鼠自由摄取食、水，IACUC号：ILAS-YZW17007。 2 方法 2.1 动物模型制备 C57小鼠根据体重，三溴乙醇麻醉0.18ml/10g体重，（360mg/kg体重）（三溴乙醇储存液：25g三溴乙醇+15.5ml叔戊醇，使用液：0.50ml储存液+39.5ml生理盐水），俯卧位固定于加热垫上保持体温，背部颈部脱毛膏脱毛，酒精消毒处理，无菌手术剪剪开后背颈部皮肤，用镊子将皮下探查出一个可以足够装下药品的空间，将DOCA 缓释泵塞入皮下，镊子将该处皮肤对齐复合，无菌缝合线缝合皮肤，放置在加热板上保暖，待苏醒后放回鼠盒，手术后用止痛果冻缓解疼痛。 2.2 标本采集及处理   完成DOCA+高盐干预21天后，称体重，麻醉后腹主动脉采血至死亡，室温静置2h后于4℃ 3000r离心10分钟提取血清，-80℃冰箱冻存。取心脏、主动脉做石蜡切片，10%中性福尔马林中固定，30%蔗糖脱水，冰冻切片包埋剂包埋并切片；进行免疫组化及免疫荧光检测，其余血管组织液氮冷冻-80℃保存，提取蛋白进行免疫印迹检测。

慢性心力衰竭（Chronic heart failure, CHF）是由于心脏结构或功能异常导致 心室充盈或射血能力受损的复杂临床综合征, 是多种心脏病终末阶段的临床表现。慢性心衰患者的再 入院死亡率每年约为 20%，五年死亡率接近 50% 。因此，在机体出现心衰之前早期防治应该是治疗研究的重点，阻止心肌损伤和重构，是降低心衰发生发展的关键。 本研究设计基于同源重组理论，利用胚胎干细胞打靶及显微注射技术，构建了Drd5floxp/flox小鼠，利用Cre/LoxP系统复制Drd5在心肌细胞可诱导性条件敲除小鼠(Drd5flox/flox, Myh6 CreERT2)，在成年后特异性心脏敲除Drd5，得到可稳定遗传、既有明显表型又保持原有生存率的心肌病模型.该小鼠给予他莫昔芬诱导后两周表现为左心室肥厚，6周后射血分数和短轴缩短率持续降低，心腔扩大，室壁变薄，心肌纤维增多，心功能严重受损。

一、模型设计原理： GRNA介导Cas9蛋白剪切目标外显子两端的内含子DNA，同时提供同源模板Donor，基因组两端通过同源重组修复方式进行DNA修复，在特定外显子两端插入FloxP。Drd5-FloxP小鼠与组织特异性表达Cre小鼠交配，从而实现Drd5基因条件性敲除的目的。实验采用最新的spCas91.1进行注射，减少了基因组中的off-Target。 根据Drd5基因组结构和蛋白功能保守区分析可知：Exon2（aa1-478）为公共外显子，位于蛋白功能保守区上：7tm_GPCRs superfamily domain，条件性删除这个外显子后，将破坏7tm_GPCRs superfamily domain,蛋白失活。因此决定在Exon1的两边定点插入FloxP位点，实现将Exon1条件性敲除。 Drd5基因存在1种转录产物，见下图： http://uswest.ensembl.org/Mus_musculus/Gene/Summary?db=core;g=ENSMUSG00000026496;r=1:180568924-180601254 1）GRNA靶点设计及活性检测 在要删除的Exon1外显子两端，设计gRNA靶点如下 靶点名称 靶点序列（标灰为PAM序列） 活性分析 Drd5-L1  GCGCGCTGCCGACAGGATCGG 10% Drd5-L2 TCCCATCCTGGGGACTAGAGG 60% Drd5-L3 GCAGGGTGAGCGCCCCTCGGG 40% Drd5-L4 TGACCGTCCCCAGACCCGAGG 50% Drd5-R1 TGTTCTGTGACTTGCACCTGG 95% Drd5-R2 GAGTGGCAATTGCTGGTATGG 95% Drd5-R3 GCAGCAGCCCGAGAACAGGGG 85% Drd5-R4 TTTCTCCCTGATTTGTTGTGG 85% Drd5-R5 CACTTTCTCGTCTCTAAAGGG 95%   使用Cas9/gRNA靶点效率检测试剂盒（货号：VK007）进行gRNA体外活性检测，结果如下： gRNA靶点活性检测结果 靶点活性数据分析如下： 根据活性检测结果，我们选用活性最高的L2,R1进行F0代首建鼠构建。 2）PCR结果分析 扩增说明 引物名称 引物序列（5’-3’） PCR产物大小 使用如下引物进行目的条带扩增  两端floxp插入 F CTGGGCTTGGGGCGAGGGTAT KI-floxp：2564 bp 测序 R GAGAAACACTGAGCACCAACTG WT：2496 bp   M-CKO-M30 (1-19,NC)目的带扩增琼脂糖凝胶电泳结果如下图：    M：BM2000 Marker，如右图所示 NC:阴性对照 如图所示，5♂扩出目的条带 3）Drd5floxp/flox小鼠测序结果分析 以M-CKO-M30-5小鼠测序结果为例，测序结果标注如下：   5’端FloxP比对结果： 3’端FloxP比对结果：   5♂xC57♀（1-9♂；10-18♀）用引物F2/R2扩增琼脂糖凝胶电泳结果如下图：   WT：野生型对照      NC:阴性对照，如图所示，2#,4-6#,8#,11#,16#扩出双带   5♂xC57♀（1-9♂；10-18♀）用引物F/R扩增琼脂糖凝胶电泳结果如下图：     4）Drd5floxp/flox小鼠测序结果分析 将2#，4-6#，8#，11#和16#由引物F/R做PCR得到的产物送测序，测序结果分析2#，4-6#，8#，11#和16#小鼠均为两端精确插入floxp序列的杂合子。 5）Drd5心肌细胞可诱导性条件性基因敲除小鼠的繁育及鉴定结果： Drd5floxp/flox小鼠与Cre 的小鼠（Myh6 CreERT2）杂交，对后代自交获得的小鼠进行基因型鉴定，成功获得Drd5心肌细胞诱导性条件性基因敲除小鼠Drd5myh6-creERT2）。见下图 M:Marker;3,4,5,6,8,9,10,11:Drd5flox/flox,Myh6 CreERT2;1,2,5,7:Drd5 flox/flox

高血压是一种由环境因素、遗传因素和行为因素相互作用产生的复杂心血管症状，其中高盐摄入是最重要的环境因素之一。我国目前高血压患者已有2亿多人，其中盐敏感性高血压患者约占总患者的50%。所谓血压的盐敏感性是指相对高盐摄入所引起的血压升高，且往往伴随动脉粥样硬化、脑卒中、慢性肾病等更严重的靶器官损伤。目前全球约有62%的卒中事件和49%的心血管事件是由高血压直接引起的。盐敏感高血压病理机制复杂，动脉血管收缩及肾脏钠水代谢潴留被认为是主要发病机制之一。 我国目前抗高血压药物也主要通过舒张血管和利尿等方法降低血压，但遗憾的是药物治疗的患者仍有近半数没能有效控制血压，更缺乏对靶器官损伤及相关并发症的有效控制。

1、模型设计原理： GRNA介导Cas9蛋白剪切目标外显子两端的内含子DNA，同时提供同源模板Donor，基因组两端通过同源重组修复方式进行DNA修复，在特定外显子两端插入FloxP。 NHE1-FloxP小鼠与组织特异性表达Cre小鼠交配，从而实现NHE1基因条件性敲除的目的。实验采用最新的spCas91.1进行注射，减少了基因组中的off-Target。   2、动物模型制备 2.1 NHE1floxp/flox小鼠鉴定PCR结果分析 引物设计 引物名称 引物序列（5’-3’） PCR产物大小 跑胶检测L端floxp插入情况 F1 GTCCTCTGACATCCACCCAT KI-floxp：297bp WT：263bp R1 GGAGCCAGAAGAACAGAAGGT 跑胶检测R端floxp插入情况 F2 GGTCACACCACACGCACAT KI-floxp：239bp WT：205bp R2 TCAGTTCCGCCGCACTCTA 测序确认两端floxp插入情况 F CCGCCAAGCCTGAAGACTT KI-floxp：1259bp WT：1191bp R TATGAACAGAAGCAGGAAGAAGC       2.2 NHE1flox/flox, Plt Cre小鼠测序结果分析 经鉴定1#和4#为NHE1flox/flox, Plt Cre 条件性敲除小鼠。   3. 标本采集及处理   条件性敲除小鼠2月龄后，称体重，麻醉后腹主动脉采血至死亡，室温静置2h后于4℃ 3000r离心10分钟提取血清，-80℃冰箱冻存。取心脏、主动脉做石蜡切片，10%中性福尔马林中固定，30%蔗糖脱水，冰冻切片包埋剂包埋并切片；进行免疫组化及免疫荧光检测，其余血管组织液氮冷冻-80℃保存，提取蛋白进行免疫印迹检测。

社会型人格障碍(antisocial personality disorder)又称无情型人格障碍是对社会的危害更为严重的一种精神疾病类型。该病是一种犯罪型人格障碍，其患病率在发达的国家为4.3-9.4%，其特征是高度攻击性，行为受偶然动机驱使，社会和人际关系适应不良，常有较严重的反社会行为，危害自己及他人的生命和财产安全（沈渔邨等，2009）。目前造成抑郁症、孤独症以及反社会行为的遗传机制不明，因此本模型的目的是揭示机体响应外在社会压力，并调控个体社会行为的主要基因，及其作用通路，作用脑区,为明确动物行为调控的分子机制，预防和治疗精神疾病提供依据。

1.材料和试剂（Materials） 　　0.5% 戊巴比妥溶液（Sigma，美国）,青霉素、链霉素粉末 (Sigma，美国), 牙科水泥(KY195，上海新世纪，中国), 75% 酒精、无水乙醇、甲醇、二甲苯（北京化工厂，中国） 0.9% 生理盐水（山东华鲁制药有限公司，中国），0.01M PBS缓冲体系（中杉金桥生物技术有限公司，中国），人工脑脊液（ACSF ，Sigma，美国）, 催产素（Oxytocin，SLBM4784V, Sigma-Aldrich），催产素受体拮抗剂（OTR-antagonist，L2540，Sigma-Aldrich）。 　　手术刀柄（RWD，中国），刀片（RWD，中国），眼科镊（RWD，中国），手术剪（RWD，中国），止血钳（RWD，中国）。   2．仪器设备（Equipment） 　　1ml 注射器双管微量给药系统：(C=6.5mm, C.C=2.6mm, D=0.48mm)，包括：1)双导管；2)导管帽芯；3)注射内管；4）导管帽；共4个配件（RWD，中国），脑立体定位仪（Stoelting）（RWD，中国），电动颅骨钻（RWD，中国）。冰冻切片机（Leica CM1950，Leica，德国）；Micro Punch针（0.5mm，1.0mm）（北京明阳科华生物科技有限公司）；组织研磨器（天根生化科技北京有限公司）；微量自动进样泵，RWD，中国），微量注射器（Hamilton Co, Bonaduz, Switzerland），                　　蠕动泵（保定齐力恒流泵有限公司）；精准电子天平（上海民桥电子天平厂），离心机（Thermo Fisher Scientific，美国），移液器 （Gilson公司，法国）；超净工作台（TBD生物仪器厂，中国）；水浴锅（黄石市恒丰医疗器械厂）;动物行为学视频跟踪系统（Noldus Information Technology，EthoVision XT，The Netherlands)。 　　三箱装置测试区域由3个相邻的箱体组成(长105 cm×宽40 cm×高35 cm)，中间2个透明塑料分隔器分隔，并通过开放的门道使三箱连通起来。实验于暗光周期1 h后开始，行为过程采用摄像记录设备(夜视模式)记录后进行分析。 　　布氏田鼠是我们自己培育的封闭群，使用的是繁殖到18代的田鼠。我们所有的实验用动物都饲养在独立送排风净化动物笼（Individual Ventitaled Cage, IVC）系统里，其饲养的笼具规格是（L x W x H = 30 x 20 x 30 cm）,每笼饲养三只。动物房的昼夜节律是12：12，室温保持在22 ± 2℃，湿度是50 ± 5%。田鼠自由摄食和饮水。动物饮水、垫料和笼具均经高压灭菌处理，饲料经CO60照射消毒达到SPF级动物饲料标准。所有实验动物的使用通过了中国医学科学院医学实验动物研究所的实验动物使用和管理委员会批准，批准编号：ILAS-PG-2014-011。

（1）内侧杏仁核中催产素对布氏田鼠社会行为的影响（四川动物）2017，36(2)：193-197。 （2）伏隔核区Jak/Stat3抑制剂注射调控布氏田鼠的能量代谢四川动物,2018,37(01):57-61. （3）Regulation of social behaviors by p-Stat3 via oxytocin and its receptor in the nucleus accumbens of male Brandt's voles (Lasiopodomys brandtii) Hormones and Behavior，2019， Accepted 12 November 2019.

人体受到辐射事故照射或者肿瘤患者放射治疗时，造血系统是辐射损伤敏感的靶器官。在接受到亚致死剂量照射后，不仅出现急性放射病，表现为全血下降、出血、感染等急性骨髓抑制表现；急性损伤的救治主要是细胞因子提高造血能力及支持疗法。部分患者经过治疗后还会出现远期损伤，表现为持续性骨髓抑制，由于起病隐匿，没有有效治疗方法，预后不良。

（一）实验材料 1.实验动物 FOXO3A基因敲除FVB/N小鼠（FOXO3A+/-）由中国医学科学院医学实验动物研究所张连峰教授课题组保存（store number：016132-UCD），雌性小鼠4只，SPF级，体重16~18g，5周龄；野生型雄性FVB/N小鼠2只，SPF级，体重16~18g， 5周龄，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供［SCXK（京）2016-0011］; FOXO3A基因敲除C57BL/6J小鼠（FOXO3A+/-）由中国医学科学院医学实验动物研究所张连峰教授课题组通过CRISPR/Cas9基因编辑技术制备，雌性小鼠5只，SPF级，体重15g，4周龄；野生型雄性C57BL/6J小鼠5只，SPF级，体重18~20g， 6~8周龄，由北京华阜康生物科技股份有限公司提供［SCXK（京）2014-0004］。实验方案通过中国医学科学院医学实验动物研究所实验动物管理和使用委员会（IACUC）审批，IACUC号为：MAM17002。实验动物饲养繁育和实验过程中，在不影响实验要求和实验结果的基础上，严格按实验动物使用的3R原则（减少、替代、优化）关注实验动物福利。 2.试剂与仪器 EDTA-K3购自Sigma公司，甲基纤维素培养基购自Stem cell Technologies公司，流式抗体CD4、CD8、B220、Ter119、Gr-1、CD11b、Streptavidin、scal-1、ckit均购自BD Bioscience和 eBioscience公司；X-RAD 225高能量生物学X射线辐照仪（美国）， FACS Aria TMⅡ流式细胞仪（BD Bioscience）， DX120全自动血液分析仪（ABX PENTRA）， CKX41倒置显微镜（奥林帕斯）。   （二）实验方法  1. 小鼠分组和照射 小鼠均分为四组：野生型小鼠对照组（WT组），FOXO3A-/-小鼠对照组（FOXO3A-/-组），野生型小鼠照射组（WT+IR）, FOXO3A-/-小鼠照射组（ FOXO3A-/-+IR），分别接受假照射和4Gy X-线全身照射（TBI），照射剂量率为0.9Gy/min。接受TBI小鼠于SPF级动物房中饲养，每天观察记录体重变化。 2 小鼠外周血常规检测 小鼠TBI 后14d小鼠眼眶静脉丛取血，抗凝管收集外周血，全自动血液分析仪测定外周血中白细胞数（WBC）、红细胞数（RBC）、血红蛋白含量（HGB）和血小板（PLT）等指标。 3 小鼠胸腺、脾脏指数测定 小鼠TBI 后14d称重安乐死，取胸腺、脾脏并称重，计算脏器指数，脏器指数=脏器(mg)/体重(g)。 4 骨髓细胞有核细胞计数 小鼠TBI后14d，无菌分离小鼠胫骨和股骨，剔除肌肉，注射器冲洗骨髓细胞，过滤后采用KOVA一次性计数板，显微镜下人工骨髓计数。最终细胞计数结果以每只小鼠×107个细胞表示。 5 小鼠骨髓细胞表型分析 小鼠TBI后14d，收集骨髓细胞至流式管，加入Biotin标记的混合一抗抗体（CD4、CD8、B220、Ter119、Gr1、cd11b），孵育后洗涤并重悬细胞，加入混合二抗抗体streptavidin（percp标记）、scal-1（PE标记）、ckit（APC标记），孵育后洗涤并重悬细胞。流式细胞仪检测HPCs（Lin− c-kit+ Sca1−or LSK- cells），HSCs（Lin− c-kit+ Sca1+or LSK+ cells）[19]在骨髓中所占的比例。 6 粒细胞巨噬细胞集落形成单位（Clony forming unit-granulocyte and macrophage，CFU-GM）测定[6] 小鼠TBI 后14d安乐死，分离骨髓细胞并分组混合，每组接种40000个细胞到分装好的2ml的3534培养基中。按操作说明进行后续接种。接种细胞培养5~7d后于倒置显微镜下读取CFU-GM数，细胞数≥50为阳性集落。结果换算为每105个BMNCs中CFU-GM的个数。 7 统计学方法 对数据进行分析方差分析（ANOVA）。组间方差分析比较时，使用用于多重比较的the Student–Newman–Keuls test。两组计量资料比较时使用非配对Student's t 检验，差异P<0.05时认为具有统计学意义。所有这些分析使用GraphPad Prism软件(San Diego，CA，USA)。

1.王玉全,李程程,苏路路,管博文,卢延华,孟爱民,樊飞跃. FOXO3A基因敲除小鼠繁殖鉴定及骨髓造血干细胞表型初步分析[J].中国比较医学杂志,2019,29(01):41-46. 2.王玉全,李程程,苏路路,管博文,卢延华,关菲菲,荣利,王小春,孟爱民,樊飞跃. FOXO3A对全身照射小鼠造血系统辐射损伤的影响[J].中国比较医学杂志,2019,29(9):10~16.

随着科学技术的进步，核电设施使用增多，人类太空活动能力提升使辐射暴露的可能性不断增加。另外临床接受放射性治疗癌症患者也在不断上升。造血系统和免疫系统对电离辐射（Ionizing Radiation，IR）具有高度的敏感性。受照后不仅会引起急性骨髓抑制，对远期造血免疫功能也会有影响。受到亚致死剂量照射后会出现造血免疫系统急性损伤性变化。随着时间延长机体各项免疫指标逐步恢复，但也会出现一些持久性改变，从而影响机体的健康状态。

实验材料 1.实验动物 10~12周龄的SPF级雄性健康C57BL/6J小鼠，体重22~24g，共24只，购于北京华阜康生物科技股份有限公司[SCXK（京）2014-0004]。小鼠饲养于中国医学科学院放射医学研究所动物房屏障环境[SYXK(津)2014－0002]。本实验经过中国医学科学院放射医学研究所IACUC的批准，批准号为1402。并根据3R原则对实验动物的使用和饲养给予人道关怀。   2.试剂与仪器 荧光标记抗体NK1.1-FITC购于Biolegend公司；CD11b-APC，购于Invitrogen公司；B220-percp、F4/80-PE、CD4-PE-cy7、CD8a-APC-cy7购于BD公司；B220-percp-cy5.5、CD3-APC购于biolegend公司。EDTA-K3购于sigma公司。红细胞裂解液购于Invitrogen公司。大鼠脾脏单个核细胞分离液试剂盒购于索莱宝公司。EasySep™ Mouse T Cell Isolation Kit购于STEMCELL Technologies公司。全自动血液分析仪MEK-7222K（日本光电）；BD流式分析仪（BD FACSAria II cell sorter，BD Bioscience ）。铯源伽马射线辐照仪（Gammacell-40，加拿大原子能有限公司）。   实验方法  1.小鼠分组和照射 小鼠均分为三组：对照组（假照射组），4Gy IR组（4Gy组），6Gy IR组（6Gy组）,照射剂量率为1Gy/min。小鼠于SPF级动物房中饲养，照射后每天观察记录体重变化。 2 小鼠外周血常规检测 小鼠TBI 后6 m小鼠眼眶静脉丛取血，抗凝管收集外周血，全自动血液分析仪测定外周血中白细胞数（WBC）、红细胞数（RBC）、血红蛋白含量（HGB）和血小板（PLT）等指标。 3 小鼠胸腺、脾脏指数测定 小鼠TBI 后6 m称重安乐死，取胸腺、脾脏并称重，计算脏器指数，脏器指数=脏器(mg)/体重(g)。 4 外周血免疫细胞和脾脏淋巴细胞分型检测 小鼠TBI后6 m，将分离的小鼠脾脏研磨制备脾细胞悬液。分别取外周血和细胞悬液50 μL，各加入1 mL 1×红细胞裂解液，室温条件下裂解8min（期间混匀两次），1500 r/min离心5 min，4℃。弃上清，保持每个样本100 μL体系，加入对应的混合抗体，冰上避光孵育30 min。2 mL PBS洗一遍，离心条件不变。加入300 μL PBS过滤到流式管中，上机检测。 5 脾脏T细胞分离及P16 mRNA表达量检测 小鼠TBI后6 m，按索莱宝ficoll试剂盒和STEMCELL Technologies的T细胞阴选试剂盒说明书方法进行分离。将收集的细胞重悬计数，按每1~5 × 106个细胞加入1 mL trizol保存，送至上海欧易生物医学科技有限公司检测P16 mRNA表达量。 6 统计学方法 采用GraphPad Prism 6软件(San Diego，CA，USA)处理数据、作图，计量资料数据用均数±标准差（x ̅± s）表示，组间差异采用ANOVA检验和卡方检验。以P< 0.05 为差异有统计学意义。

1.管博文，卢延华，苏路路，等. 亚致死剂量全身照射对小鼠造血免疫功能远期影响[J]. 中国比较医学杂志, 2019:00-00

特发性肺纤维化（Idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）是一种慢性、进行性、纤维化性间质性肺疾病，病变局限在肺脏，好发于中老年人群，其肺组织学和/或胸部高分辨率CT（HRCT）特征性表现为普通型间质性肺炎（UIP），病因不清。按病程有急性、亚急性和慢性之分，本病多为散发，据统计，每年整体人群中的患病率约（2～29）/10万，且呈逐渐增长趋势，估计以每年11%的比例增长。在美国特发性肺纤维化患者大约有100000人，欧盟地区大约有110000人，而且每年欧盟地区新增IPF患者35000人。日本每年整体人群中的IPF患病率约（2.23～10）/10万，实际值远高于这个数目。我国作为一个老龄化严重的国家，目前IPF患病人数也是逐年增加，保守估计至少在50万左右。作为一种慢性间质性肺病，IPF起病隐匿、病情逐渐加重，也可表现为急性加重。IPF诊断后的平均生存期仅2.8年，死亡率高于大多数肿瘤，IPF被称为一种“类肿瘤疾病”。 2018年5月11日，国家卫生健康委员会等5部门联合制定了《第一批罕见病目录》，特发性肺纤维化被收录其中。

3.1实验动物 C57BL/6J小鼠45 只（SPF 级），体重20--22g，10-12周，购自北京华阜康生物科技股份有限公司［动物合格证：SCXK（京）2015-0035］，饲养和实验在中国医学科学院医学实验动物研究所动物房屏障环境内进行，温度为20-26℃，相对湿度50%-60%。 3.2试剂  博来霉素（BLM）：注射用盐酸博来霉素，日本化药株式会社；盐酸氯胺酮注射液：沈阳市兽药厂，兽药字（2011）060022668；细胞衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒：碧云天；核固红染色液（0.5%）：北京雷根生物技术有限公司。 3.3模型建立 14周龄的雄性小鼠按体重随机分为未处理组（n=5）和处理组（n=40），处理组气管滴注BLM溶液（0.4 mg/ ml，每只100ul），未处理组小鼠不经任何处理，处理组小鼠用注射用盐酸氯胺酮150mg/kg腹腔注射麻醉，固定，暴露声门，用接套管的1ml注射器气道给药。两星期给药一次，给药8次，第一次给药为0周，在0.5个月、1个月、2个月、4个月时分别取肺组织，称重，取右肺中叶做冰冻切片，剩余肺组织10%中性甲醛中固定制备石蜡切片做HE染色、Masson染色。 3.4 HE染色 肺组织10%中性甲醛中固定24h，常规脱水、石蜡包埋后，切片5um，进行苏木素—伊红染色，普通光学显微镜（BX50，Olympus, Japan）下观察肺组织病理学改变，病理学镜检人员进行单盲评分。 3.5 Masson染色  肺组织石蜡切片脱蜡，蒸馏水冲洗，Masson染色复合液染色5min，自来水冲洗，0.2%醋酸浸洗，自来水冲洗，1%磷钨酸，水洗后亮绿染色液染色15min，水洗，0.2%醋酸浸洗，水洗片刻，脱水、透明、固封。 3.6 肺系数 小鼠在BLM处理0.5个月、1个月、2个月、4个月四个时间点分别取肺组织，称重，计算肺系数。肺系数=肺组织重量（mg）/小鼠体重（g）。 3.7 冰冻切片  小鼠在0.5个月、1个月、2个月、4个月四个时间点分别取右肺中叶，速冻后，将肺组织浸没在适量的包埋剂中，用冰冻组织切片机制作8um的切片。 3.8 细胞衰老β-半乳糖苷酶染色方法  肺组织冰冻切片按试剂盒说明操作。先用试剂盒中固定液固定15min，PBS洗3次，每次3min，配置染色液，滴加到冰冻切片上，37℃培养箱（无CO2）过夜后，PBS洗一遍，核固红（0.5%）复染15min，使细胞核变为红色，便于区分细胞。 3.9 统计学分析 采用SPSS 22.0统计软件对数据进行分析，结果以均数±标准差（±S）表示，多组间比较采用单因素方差分析和t检验，P<0.05 为差异有统计学意义。

陈孟毅, 林帅, 杜朋,李程程，孟爱民.博来霉素气管多次给药诱导小鼠肺纤维化模型[J]. 中国医药导报, 2017, 14(2): 8-11. 陈孟毅，孟爱民. 肺纤维化动物模型及研究进展. 中国比较医学杂志，2016, 26(6):88-93

家族性腺瘤性息肉病(Familial Adenomatous Polyposis，FAP)是结直肠癌发生的癌前病变,患者结直肠部位多发成百上千个腺瘤性息肉，抑癌基因APC的突变是结直肠肿瘤的起始因素。Dove实验室于1990年建立了C57BL/6J-APCmin/+小鼠品系，是在小鼠同源APC基因第850位点发生无义突变，造成其肠道多发腺瘤，被认为是一种良好的FAP小鼠模型。

　　包括实验材料（实验动物、试剂、仪器）、实验环境、细胞培养/载体构建//蛋白表达/病原培养鉴定方法、实验操作规程、动物处理伦理等内容。 　　APCMin/+小鼠，C57BL/6J小鼠，体重秤，清洁级动物房，手术剪，耳标，IVC笼盒，Co60照射的高脂饲料，PBND，蛋白酶K, promega GO TAQ Green Master Mix, takara 100bp DNA ladder, TBE缓冲液，亚甲蓝，小鼠抗人β-catenin单克隆抗体(BD Trans-ductionLaboratorie,Cat,610154),小鼠抗人cyclinD 1(SantaCruz,Cat,sc-8396);二抗为过氧化辣根酶标记山羊抗小鼠IgG, DAB显色液，苏木精染液，显微镜，凝胶成像仪，甘油三酯试剂盒及总胆固醇试剂盒等。 　　实验操作规程： APCMin/+雄性成年小鼠和C57雌性成年小鼠以1∶2的比例杂交，三个月后，其F1代中既有APCMin/+小鼠（腺瘤表型），又有C 57小鼠，进行全同胞兄妹交配，扩大种群。使用PCR方法对新生小鼠进行剪尾提取基因签定。小鼠在正常饲养时或者高脂饲料饲养时均会出现肠道肿瘤，但是肿瘤数量，体积随着饲养年龄增长而具有明显差异。

实验动物：Lgr5-EGFP-CreERT2小鼠，ROSA26-tdTomato小鼠，Stat5 或 icS5 floxed小鼠 试剂：tamoxifen(100mg/kg)，4%PFA 仪器：冰冻切片机，leica DMI8活细胞工作站 实验操作规程：将Lgr5-CreGFP;RstdToamto-CreER 小鼠系与Stat5 或 icS5 floxed小鼠杂交，分别为对照组（Lgr5-CreGFP;RstdToamto-CreER）；实验1组（Lgr5-CreGFP；RstdToamto-CreER;Stat5）；实验2组（Lgr5-CreGFP；RstdToamto-CreER;icS5）。在小鼠4周龄时，提取杂交小鼠鼠尾DNA，通过凝胶电泳检测小鼠基因型。Lgr5基因PCR引物序列如下(扩增目的片段长174bp)。Common 8060：5'-CTGCTCTCTGCTCCCA GTCT-3'；Wild Type 8061：5'-ATACCCCATCCCTT TTGAGC-3'；Mutant 9402：5'-GAACTTCAGGGTC AGCTTGC-3'。PCR条件：预变性94℃3min；94℃变性30s，66℃复性1min，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸5min。选取双阳性小鼠，6~8周龄，体重20~22g。实验组小鼠按100mg/kg体重腹腔注射他莫昔芬，对照组小鼠注射等量的玉米油。通过 Tam 诱导， 然后分别在 12 小时和 1, 3, 5, 7, 30， 122和280天麻醉处死各组小鼠。分别取结肠、空肠、回肠组织，用冷PBS冲洗肠道组织，纵向剖开，放入多聚甲醛中固定过夜，制作冰冻切片在子代肠上皮细胞中追踪检测是否去除 Stat5 或活化 STAT5 能够改变肠上皮中的tdToamto 信号强度和位置.

1.Liu R, Moriggl R, Zhang, et al. Constitutive STAT5 activation regulates Paneth and Paneth-like cells to control Clostridium difficile colitis[J]. Life Sci Alliance, 2019,2(2):296-316.

免疫系统人源化的小鼠模型可以用于所有针对人免疫系统所产生的疾病。该模型在细胞发育、感染性疾病、自身免疫病以及肿瘤治疗等领域有很多的应用，为研究临床疾病提供了良好的研究平台。

1.实验动物 NRG小鼠：NOD-scid小鼠敲除Rag1和Il2rg，购于美国实验室。 饲养场所：中国医学科学院医学实验动物研究所SPF动物房的隔离器。 2.试剂 Histopaque（1.077g/ml）淋巴细胞分离液 CD34+HSC分离试剂盒 抗小鼠 PE-CD45 抗人 APC-CD3 抗人 APC CY7-CD45 无血清干细胞培养基 3.仪器和耗材 生物安全柜 低温高速离心机 倒置显微镜 0.5 mL胰岛素注射器 4.细胞 脐带血来自合作医院或者脐血库（具有伦理证明）。 根据用CD34纯化干细胞试剂盒，纯化脐带血中造血干细胞，纯化的细胞当天移植。 5.移植 1）选取新生鼠或者4周雌鼠，用X-RAY辐照仪照射，剂量是 1.5Gy。 2）将纯化的 CD34+造血干细胞尾静脉注入照射后的小鼠体内，每只小鼠注射1×10e5 细胞。 3）12周后，采血检测人细胞的比例：抗小鼠 PE-CD45；抗人 APC CY7-CD45；抗人 APC-CD3。 6.动物IACUC：YHS18001-于海生-人源化小鼠模型的构建   7.制备流程图：

1. Cheng L, Yu H, Li G, Li F, Ma J, Li J, Chi L, Zhang L, Su L. (2017). "Type I interferons suppress viral replication but contribute to T cell depletion and dysfunction during chronic HIV-1 infection." JCI Insight 2(12).