可诱导型心脏Drd5基因条件性敲除小鼠模型-

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CSTR:16397.09.0I01000716

资源中文名称

可诱导型心脏Drd5基因条件性敲除小鼠模型

资源英文名称

Drd5flox/flox, Myh6 CreERT2

疾病概述

慢性心力衰竭（Chronic heart failure, CHF）是由于心脏结构或功能异常导致心室充盈或射血能力受损的复杂临床综合征, 是多种心脏病终末阶段的临床表现。慢性心衰患者的再入院死亡率每年约为 20%，五年死亡率接近 50% 。因此，在机体出现心衰之前早期防治应该是治疗研究的重点，阻止心肌损伤和重构，是降低心衰发生发展的关键。本研究设计基于同源重组理论，利用胚胎干细胞打靶及显微注射技术，构建了Drd5floxp/flox小鼠，利用Cre/LoxP系统复制Drd5在心肌细胞可诱导性条件敲除小鼠(Drd5flox/flox, Myh6 CreERT2)，在成年后特异性心脏敲除Drd5，得到可稳定遗传、既有明显表型又保持原有生存率的心肌病模型.该小鼠给予他莫昔芬诱导后两周表现为左心室肥厚，6周后射血分数和短轴缩短率持续降低，心腔扩大，室壁变薄，心肌纤维增多，心功能严重受损。

实验动物背景信息

C57BL/6小鼠

模型制作方法

一、模型设计原理：

GRNA介导Cas9蛋白剪切目标外显子两端的内含子DNA，同时提供同源模板Donor，基因组两端通过同源重组修复方式进行DNA修复，在特定外显子两端插入FloxP。Drd5-FloxP小鼠与组织特异性表达Cre小鼠交配，从而实现Drd5基因条件性敲除的目的。实验采用最新的spCas91.1进行注射，减少了基因组中的off-Target。

根据Drd5基因组结构和蛋白功能保守区分析可知：Exon2（aa1-478）为公共外显子，位于蛋白功能保守区上：7tm_GPCRs superfamily domain，条件性删除这个外显子后，将破坏7tm_GPCRs superfamily domain,蛋白失活。因此决定在Exon1的两边定点插入FloxP位点，实现将Exon1条件性敲除。

Drd5基因存在1种转录产物，见下图：

http://uswest.ensembl.org/Mus_musculus/Gene/Summary?db=core;g=ENSMUSG00000026496;r=1:180568924-180601254

1）GRNA靶点设计及活性检测

在要删除的Exon1外显子两端，设计gRNA靶点如下

靶点名称	靶点序列（标灰为PAM序列）	活性分析
Drd5-L1	GCGCGCTGCCGACAGGATCGG	10%
Drd5-L2	TCCCATCCTGGGGACTAGAGG	60%
Drd5-L3	GCAGGGTGAGCGCCCCTCGGG	40%
Drd5-L4	TGACCGTCCCCAGACCCGAGG	50%
Drd5-R1	TGTTCTGTGACTTGCACCTGG	95%
Drd5-R2	GAGTGGCAATTGCTGGTATGG	95%
Drd5-R3	GCAGCAGCCCGAGAACAGGGG	85%
Drd5-R4	TTTCTCCCTGATTTGTTGTGG	85%
Drd5-R5	CACTTTCTCGTCTCTAAAGGG	95%

使用Cas9/gRNA靶点效率检测试剂盒（货号：VK007）进行gRNA体外活性检测，结果如下：

gRNA靶点活性检测结果

靶点活性数据分析如下：

根据活性检测结果，我们选用活性最高的L2,R1进行F0代首建鼠构建。

2）PCR结果分析

扩增说明

引物名称

引物序列（5’-3’）

PCR产物大小

使用如下引物进行目的条带扩增

两端floxp插入	F	CTGGGCTTGGGGCGAGGGTAT	KI-floxp：2564 bp
测序	R	GAGAAACACTGAGCACCAACTG	WT：2496 bp

M-CKO-M30 (1-19,NC)目的带扩增琼脂糖凝胶电泳结果如下图：

M：BM2000 Marker，如右图所示

NC:阴性对照

如图所示，5♂扩出目的条带

3）Drd5^floxp/flox小鼠测序结果分析

以M-CKO-M30-5小鼠测序结果为例，测序结果标注如下：

5’端FloxP比对结果：

3’端FloxP比对结果：

5♂xC57♀（1-9♂；10-18♀）用引物F2/R2扩增琼脂糖凝胶电泳结果如下图：

WT：野生型对照 NC:阴性对照，如图所示，2#,4-6#,8#,11#,16#扩出双带

5♂xC57♀（1-9♂；10-18♀）用引物F/R扩增琼脂糖凝胶电泳结果如下图：

4）Drd5^floxp/flox小鼠测序结果分析

将2#，4-6#，8#，11#和16#由引物F/R做PCR得到的产物送测序，测序结果分析2#，4-6#，8#，11#和16#小鼠均为两端精确插入floxp序列的杂合子。

5）Drd5心肌细胞可诱导性条件性基因敲除小鼠的繁育及鉴定结果：

Drd5^floxp/flox小鼠与Cre 的小鼠（Myh6 CreERT2）杂交，对后代自交获得的小鼠进行基因型鉴定，成功获得Drd5心肌细胞诱导性条件性基因敲除小鼠Drd5myh6-creERT2）。见下图

M:Marker;3,4,5,6,8,9,10,11:Drd5^flox/flox,Myh6 CreERT2;1,2,5,7:Drd5^flox/flox

模型表型数据

Drd5^flox/flox,Myh6 CreERT2小鼠结果分析

1.生理生化分析：

图1.生化指标显示Drd5^flox/flox,Myh6 CreERT2小鼠肌酸激酶（CK）较WT组显著升高，提示心功能受损，但是肝功能和肾功能marker未见显著差异。

2.大体及心脏超声结果：

图2.他莫昔芬诱导心肌Drd5基因敲除后，如图所示心脏体积逐渐扩大。超声结果显示，敲除两周后心室壁变厚，心腔容积变小，表现为心室肥厚；敲除6周后，心室壁变薄，心腔容积变大，射血分数与短轴缩短率均大幅下降，心功能严重受损。

3.纤维化结果：

图3.Drd5^flox/flox,Myh6 CreERT2小鼠经过他莫昔芬诱导后，心脏Masson染色显示心肌细胞纤维化明显， western blot显示纤维化marker MMP2随敲除时间逐渐增加。免疫荧光显示KO小鼠心肌凋亡marker表达显著增加。

动物模型的评价与验证

基于模型制备三原则（表观效度、预测效度以及结构效度）对模型指标进行评价，其中包括整体行为特征、组织器官、细胞和分子等在内的指标评价体系。评价方法包括以整体实验为主，涵盖行为、影像、生理生化和组织切片等技术方法进行详细介绍。采用的仪器设备、试剂应满足模型评价的要求，指标完善，条件稳定。评价指标包括核心指标（如特异的基因改变、特异的染毒病原株或高载量病毒核酸、特异性免疫抗体）；主要指标（模拟人类疾病临床症状和体征、易感器官的特征性改变和特异性生物标志物）；重要指标（模拟疾病某些方面的改变的指标）和辅助指标

保存方式

活体繁殖

合作方式

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