c57bl/6小鼠也被称为c57 black 6，1921年被培育出来，属于近交品系。该品系的最主要的两个特点就是品系稳定和易于繁殖。另外c57bl/6小鼠是第一个完成基因组测序的小鼠品系。

3.1 实验材料

3.1.1 实验动物

本实验使用SPF级C57BL及ICR小鼠，购买于北京维通利华实验动物有限公司【SCXK（京）2012-001】并在本所SPF级动物屏障环境动物房[SYXK(京)2015-0035]中长期饲养繁殖。涉及动物操作程序和动物实验经本所动物使用与管理委员会（IACUC）批准，批准号为BL18003。

3.1.2实验仪器

3.1.3实验试剂

3.1.4模型构建流程

利用CRISPR /Cas9 技术，建立CTLA4基因人源化小鼠模型，利用PCR、RT-PCR和Western Blot 的方法进行鉴定及分析。

3.1.5 CTLA4人源化小鼠的建立

3.1.5.1 CTLA4人源化小鼠模型的建立

（1）设计方案

1，sgRNA 载体

• 载体名称：pUC57-sgRNA expression vector
• Addgene ID: 51132
• 根据基因信息选择靶点，合成sgRNA（上海英潍捷基）

• m-ctla4-gRNA up1      5’TAGGgggttcaaacacatctca
• m-ctla4-gRNA down1    5’aaacTGAGATGTGTTTGAACCC
• targeting site 2:
• gagacttctggaacatgg    aGg
• m-ctla4-gRNA up2      5’TAGGgagacttctggaacatgg
• m-ctla4-gRNA down2    5’aaacCCATGTTCCAGAAGTCTC
• 合成的sgRNA单链通过退火复性结合成小片段，插入BSAⅠ线性化的载体
• sgRNA插入位点示意图
• 

图1 CTLA4人源化小鼠模型构建设计方案

• 构建完成的sgRNA载体通过体外转录成为可注射的sgRNA。（体外转录用试剂盒：Ambion  Am1354）
• 2，CAS9 载体
• 载体名称：pST1374-NLS-flag-linker-Cas9
• Addgene ID: 44758
• 载体通过体外转录成为可注射的Cas9-RNA（体外转录用试剂盒：Ambion  Am1345）
• 显微注射
• 1，超数排卵：15只3-4周龄c57雌鼠注射激素进行超排。
• 2，受精卵注射：取约150枚受精卵进行注射。
• 3，雄鼠结扎：制作30只8周龄输精管结扎的c57雄鼠。
• 4，受体鼠制备：8-10周龄ICR雌鼠与结扎的ICR雄鼠交配后选取见栓的雌鼠。
• 5，胚胎移植：将注射后的受精卵移植到受体鼠输卵管壶腹部（移植一次， 120枚卵，4只受体鼠）。
• 基因型鉴定
• 1，剪尾编号：出生7-10天的乳鼠，剪取脚趾和尾尖进行编号及取材。
• 2，基因组DNA提取： 使用全式金（Transgen）公司的基因组DNA提取试剂盒（EE101-12）提取基因组DNA
• 3，PCR检测：根据序列信息设计检测引物（上海英潍捷基）
• M-CTLA4-Ki-S1    5’CTACCACTGAGCTACATCTATACCTCTGAG   
• M-CTLA4-Ki-A1    5’GCCACGTGCATTGCTTTG  
• M-CTLA4-Ki-S2    5’GGAACCCAGATTTATGTAATTGATCC    
• M-CTLA4-Ki-A2    5’TTATTGGATAGTCAGCTGGTGTGC      
• M-CTLA4-KO-S    5’AGAAATTATACTCTCCAAGACTCCACG    
• M-CTLA4-KO-A    5’CCTTAAGTCCCAGCTGAGATCC     
• KI:
• TM=62℃      上游目的片段（S1-A1）： 1101bp
•               下游目的片段（S2-A2）： 1254bp
• KO：
• TM=62℃       WT：727bp    ko: (见测序分析)
• PCR反应体系及扩增程序（TaKaRa RR042A）
• 反应体系：

• 扩增程序：

• 6×loading buffer 终止反应。
• 用1%的琼脂糖凝胶进行电泳。
• 4，结果分析： 选取PCR检测分子量不同于野生型条带的 (下图中箭头所示)，将PCR产物进行TA克隆，之后用检测引物进行菌液PCR，筛选有插入的克隆测序。
•    1-23#基因组PCR结果图（TaKaRa marker DL2000）（上游PCR结果）
•    
• 1-23#基因组PCR结果图（TaKaRa marker DL2000）（下游PCR结果）
• 
• 5，测序结果：

KI：3#，5#，9#，14#，23#

黄色绿色为检测引物，蓝色字体为同源序列，红色为H-CTLA4基因ORF，灰色为BGH poly A

ctaccactgagctacatctatacctctgagctgtgtcttcattgctgaggtatatgaactacgtctctatcactgagctgtgcctccaagttttaagtttctacctttgaaaatttttactattttttttaaaagcccatcctcctgtggaggttttaaatgtcttttcatttggattgactttctctgggccatccacaactttattttgccgttgttacagttttaaaagcatctggtttatttcccaacggacaaaaccagaggcccctttccctgttttgtgtgtgtgtgtttgtgtgtgcatatgtgtgcatgcatgtgcatgtacaaatgtgtgtgtgtctttcatttcttgtgattttggcatttttctctcagtaaaatactaagtggagttaggcaaaaataaacccttttgtgtactgaggggctcatagaaggacacaatttttcttggtgccttccaaagagaaattcagacatcagctccaggactaagagggatggccatgggacgctaagtaagagtactgggggattaaagatgaccagatgactggataaagttgggactgggatttagggattccttgtactacagaaattatactctccaagactccacgtctccaggtcctcagaggtgactcgaagcttcagtttcaagttgagtacattttccatccatggatttgcttgttttgttcagttttagtttgaatatttgaggtcgtctttacgacgtaacagctaaacccacggcttcctttctcgtaaaaccaaaacaaaaaggctctctgttcaggtgtcctgtgtgtgcactacacatatgtagcacgtaccttggatcaaagctgtctatataaagtccccgagtctgtgtgggttcaaacacatctcaaAgcttctggatcctgttgggttttactctgctccctgaggacctcagcacatttgccccccagccgccaccatggcttgccttggatttcagcggcacaaggctcagctgaacctggctaccaggacctggccctgcactctcctgttttttcttctcttcatccctgtcttctgcaaagcaatgcacgtggcccagcctgctgtggtactggccagcagccgaggcatcgccagctttgtgtgtgagtatgcatctccaggcaaagccactgaggtccgggtgacagtgcttcggcaggctgacagccaggtgactgaagtctgtgcggcaacctacatgatggggaatgagttgaccttcctagatgattccatctgcacgggcacctccagtggaaatcaagtgaacctcactatccaaggactgagggccatggacacgggactctacatctgcaaggtggagctcatgtacccaccgccatactacctgggcataggcaacggaacccagatttatgtaattgatccagaaccgtgcccagattctgacttcctcctctggatccttgcagcagttagttcggggttgtttttttatagctttctcctcacagctgtttctttgagcaaaatgctaaagaaaagaagccctcttacaacaggggtctatgtgaaaatgcccccaacagagccagaatgtgaaaagcaatttcagccttattttattcccatcaattgaCCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCtggaggaggtgtttttcctacatgggtttcgttttttttttttctttcagaagctgaggacagtgatttatagaaatgccagaagttaaagccaaaccctctactttttggtttaacagcttcctacagacaagttccaagaagaatataggaggtctagcagtagcgaaggagctgagactagccacagcagcttgctgggatctcagctgggacttaaggaaccatgagagttccttaagtcccatatgggggagaacaagttctttgtcactgctagaaaatcctgtaaagttaagagatttaaggggggcatttgaaatcgtgagtacatttgatcttgatatcacagtaacattaaggtttttctccttacccccaatcccacccccaaaacttacctaaattcaaataaataagaagttttcctcattcactttaagattttgagacactcttagttctttaaattatcacacctaaggcttaggggacatagcagaagagggggcagaaagactatgagagccaaaggtacatagagtttactgagagattgtgtctcttaggatgtcaaatggtacacccataaagtctcaccaacacgactgcctaaacttgagctgaataaggacatgaataacaatagacatacccaagtggatggggaaagaccaagatgcttcagcactatagcaataactacaggaagccaaggaatatggagagtaggaaattgccaagggaaaagcacaccagctgactatccaataa

3.1.5.2 动物繁殖和表达图谱分析

获得F0代后，首先通过与野生型C57小鼠进行杂交，进行基因修饰小鼠传代能力分析。之后CTLA4人源化小鼠通过杂合子与杂合子杂交，获得CTLA4人源化小鼠纯合子小鼠，进行蛋白表达分析，并用于后续实验。

3.1.5.3 鼠尾基因组DNA鉴定

在幼崽出生后剪脚趾标记，并剪尾至1.5 mL EP管。然后参照鼠尾直接PCR试剂盒（bimake）说明书按以下程序操作。

1.1. 按小鼠数量配制组织消化液，试剂比例如下：

组织消化液现用现配，充分混匀后使用。

1.2. 向每个含有样本的EP管中加入100 μL新鲜组织消化液，55℃水浴/金属浴中消化15 min。组织消化时，务必将组织完全浸没于消化液中。消化完成后，组织外观上仍然完整，但足量的基因组DNA已经释放，不影响后续的PCR实验。

1.3. 将样本置于95℃水浴/金属浴中孵育5 min以灭活消化液中的蛋白酶活性。12000 rpm离心5分钟，取上清作为PCR模板。消化后的上清或连同组织的消化液可于-20℃保存三个月。

2. PCR扩增

2.1. PCR反应体系：

2.2. PCR反应条件：

3. 琼脂糖凝胶电泳

试剂2 x M-PCR OPTITM Mix中含有溴酚蓝染料，PCR产物可直接点样进行琼脂糖凝胶电泳。

4.1CTLA4人源化小鼠模型的建立

将F0代小鼠与C57小鼠进行杂交，获得杂合子hCTLA4 h/m,将杂合子互交并将子代进行基因型鉴定（图2），得到纯合敲入小鼠hCTLA4 h/h。

注：使用PCR鉴定子代小鼠基因型，突变可传代。M：Marker（TaKaRa，DL2000）；H: 水。h/h：CTLA4人源化纯合子小鼠；h/m：ctla4人源化杂合子小鼠；m/m：野生型小鼠。

图2 PCR鉴定子代小鼠基因型

4.2 CTLA4人源化小鼠组织中蛋白及mRNA表达

为了鉴定转基因小鼠是否在蛋白水平发生CTLA4人源化，取1-2月龄小鼠脾、肺进行Western Blot，分别使用种属反应性为小鼠、大鼠和人，以及种属反应性为人的CTLA4抗体检测蛋白表达（图3a）。结果显示，市售的种属反应性为人的CTLA4抗体无法区分人源与鼠源的蛋白。

因为市售蛋白抗体无法区分人源与小鼠源CTLA4蛋白，使用RT-PCR鉴定人源化小鼠脾细胞（CD3抗体刺激4天）中mRNA表达（图3b）。结果可见人特异性引物（hCTLA4-F: 5’CCCTGCACTCTCCTGTTTTTTCT，hCTLA4-R: 5’TTGATTTCCACTGGAGGTGCC）只能扩增纯合子hCTLA4 h/h的cDNA，而小鼠特异性引物（mCTLA4-F: 5’CCTTTTGTAGCCCTGCTCACT, mCTLA4-R: 5’TTCACTCTGCTTTCATTAAAGGTAC。）也只能扩增hCTLA4 m/m的cDNA，可见ctla4人源化转基因小鼠中只表达人源CTLA4的mRNA。

注：m/m：野生型小鼠；h/h：CTLA4人源化纯合子小鼠。a：Western Blot 检测CTLA4蛋白在脾和肺中的表达，CTLA4：种属反应性为小鼠、大鼠和人的CTLA4抗体，；hCTLA4：种属反应性为人的CTLA4抗体。b：RT-PCR检测CTLA4 mRNA在脾中的表达，

图3CTLA4在人源化小鼠中的蛋白及mRNA表达

4.3 人源CTLA4基因可正常替代小鼠CTLA4基因

文献报道，CTLA4基因敲除小鼠会由于严重的自身免疫疾病，在出生后3-4周内死亡。但在CTLA4人源化小鼠中，没有观察等到淋巴细胞的浸润（图4g-l），并且根据我们的观察结果表明，纯合的CTLA4人源化小鼠寿命正常，在10个月内没有观察到自身免疫性疾病发展的迹象。因此，在纯合的CTLA4人源化小鼠中，人源CTLA4等位基因已功能性替代了小鼠CTLA4基因。

注：hCTLA4^m/m（a-f）及hCTLA4^h/h（g-l）小鼠的心、肝、脾、肺、肾、胸腺中无明显淋巴细胞浸润。图中显示的是心脏（a，g）、肝（b，h）、脾（c，i）、肺（d，j）、肾（e，k）、胸腺（f，l）的组织切片HE染色。比例尺=100μm。

图4各组织HE染色

4.4 人源化CTLA4基因小鼠免疫系统正常。

我们利用流式细胞术检测了野生型小鼠和人源化CTLA4基因小鼠外周血中各类细胞的比例，发现其外周血中B细胞（B220+）、T细胞（CD3+、CD4+、CD8+）、粒细胞（CD11b）和NK细胞的比例都没有明显差异。同时检测骨髓、脾脏和胸腺等免疫器官中免疫细胞的比例发现人源化CTLA4基因的小鼠和野生小鼠相比没有差异。结果说明人源化CTLA4基因后没有改变正常生理状态下小鼠免疫系统的组成（图5）。

注：m/m：野生型小鼠；h/h：CTLA4人源化纯合子小鼠。a：流式细胞术统计不同免疫细胞在外周血中的比例。B-E：流式细胞术检测不同免疫细胞的直方图。

图5 CTLA4在人源化小鼠外周血中不同免疫细胞的比例