血小板NHE1基因条件性敲除小鼠模型-

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CSTR:16397.09.0I01000715

资源中文名称

血小板NHE1基因条件性敲除小鼠模型

资源英文名称

Platelet Specific NHE1 Knock Out Mouse Model

疾病概述

高血压是一种由环境因素、遗传因素和行为因素相互作用产生的复杂心血管症状，其中高盐摄入是最重要的环境因素之一。我国目前高血压患者已有2亿多人，其中盐敏感性高血压患者约占总患者的50%。所谓血压的盐敏感性是指相对高盐摄入所引起的血压升高，且往往伴随动脉粥样硬化、脑卒中、慢性肾病等更严重的靶器官损伤。目前全球约有62%的卒中事件和49%的心血管事件是由高血压直接引起的。盐敏感高血压病理机制复杂，动脉血管收缩及肾脏钠水代谢潴留被认为是主要发病机制之一。我国目前抗高血压药物也主要通过舒张血管和利尿等方法降低血压，但遗憾的是药物治疗的患者仍有近半数没能有效控制血压，更缺乏对靶器官损伤及相关并发症的有效控制。

实验动物背景信息

C57BL/6小鼠

模型制作方法

1、模型设计原理：

GRNA介导Cas9蛋白剪切目标外显子两端的内含子DNA，同时提供同源模板Donor，基因组两端通过同源重组修复方式进行DNA修复，在特定外显子两端插入FloxP。 NHE1-FloxP小鼠与组织特异性表达Cre小鼠交配，从而实现NHE1基因条件性敲除的目的。实验采用最新的spCas91.1进行注射，减少了基因组中的off-Target。

2、动物模型制备

2.1 NHE1^floxp/flox小鼠鉴定PCR结果分析

引物设计	引物名称	引物序列（5’-3’）	PCR产物大小
跑胶检测L端floxp插入情况	F1	GTCCTCTGACATCCACCCAT	KI-floxp：297bp WT：263bp
跑胶检测L端floxp插入情况	R1	GGAGCCAGAAGAACAGAAGGT	KI-floxp：297bp WT：263bp
跑胶检测R端floxp插入情况	F2	GGTCACACCACACGCACAT	KI-floxp：239bp WT：205bp
跑胶检测R端floxp插入情况	R2	TCAGTTCCGCCGCACTCTA	KI-floxp：239bp WT：205bp
测序确认两端floxp插入情况	F	CCGCCAAGCCTGAAGACTT	KI-floxp：1259bp WT：1191bp
测序确认两端floxp插入情况	R	TATGAACAGAAGCAGGAAGAAGC	KI-floxp：1259bp WT：1191bp

2.2 NHE1^flox/flox, Plt Cre小鼠测序结果分析

经鉴定1#和4#为NHE1^flox/flox, Plt Cre 条件性敲除小鼠。

3. 标本采集及处理

条件性敲除小鼠2月龄后，称体重，麻醉后腹主动脉采血至死亡，室温静置2h后于4℃ 3000r离心10分钟提取血清，-80℃冰箱冻存。取心脏、主动脉做石蜡切片，10%中性福尔马林中固定，30%蔗糖脱水，冰冻切片包埋剂包埋并切片；进行免疫组化及免疫荧光检测，其余血管组织液氮冷冻-80℃保存，提取蛋白进行免疫印迹检测。

模型表型数据

1、血小板活化结果分析

2、生理生化结果分析

3、病理结果分析

4、血小板生成超微结构分析

动物模型的评价与验证

1.该模型的评价方法：包括以整体实验为主，涵盖大体、影像、生理生化和组织切片电镜超微结构检测等技术方法。 2.评价主要指标包括：血常规（总白细胞，血小板）；病理指标（心肌细胞水肿，肾小球）；流式指标（血小板NHE1表达及血小板P-selectin 的表达）；超微结构指标(巨核细胞中血小板的生成）

保存方式

冷冻精子

合作方式

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