阿尔兹海默病（Alzheimer’s disease, AD）是最常见的神经退行性疾病，也是最常见的痴呆疾病（dementia），随年龄的增长其发病率逐渐增加。阿尔兹海默病的致病机制尚不明确，主要分为家族性阿尔兹海默病（familial AD, FAD）和散发性阿尔兹海默病（sporadic AD, sAD）。疾病的病理表现集中在神经元之间的淀粉样蛋白斑块沉积，神经元细胞内的磷酸化Tau蛋白和神经原纤维缠结，海马区和新皮层区弥散性的神经元丢失。

为了更快促进Aβ42产生、建立AD淀粉样蛋白模型，针对5个FAD突变建立模型，分别是：APP K670N/M671L（Swedish瑞典型）、I716V（Florida佛罗里达型）、V717I（London伦敦型）和PS1 M146L、L286V，命名为5XFAD小鼠。

1. Oakley H, Cole SL, Logan S, et al., Intraneuronal beta-amyloid aggregates, neurodegeneration, and neuron loss in transgenic mice with five familial Alzheimer's disease mutations: potential factors in amyloid plaque formation. J Neurosci. 2006 Oct 4;26(40):10129-40.

阿尔兹海默病（Alzheimer’s disease, AD） 临床症状主要为记忆障碍、失语、失用、失认、视空间技能损害、执行功能障碍以及人格和行为改变等全面性痴呆表现，起病隐匿，呈进行性发展。 病理表现主要为脑组织萎缩、神经纤维缠结、老年斑形成和大量淀粉样蛋白沉积。 发病机制尚不明确，从目前研究来看，该病的可能因素和假说多达30余种，主要发病机制假说包括Aβ毒性假说，Tau蛋白代谢异常，神经炎症，胆碱能损伤，金属离子代谢紊乱，糖脂代谢紊乱，自由基损伤，神经血管功能失调，线粒体功能紊乱，兴奋性氨基酸毒性、病毒感染等。

1、模型制作 APP/PS1双转基因小鼠模型是利用PrP-hAPPK595N/M596L单转基因痴呆模型小鼠和PrP-hPS1dE9单转基因痴呆症模型小鼠杂交培育而成。   2、基因型鉴定 提取首建鼠后代鼠尾DNA，PCR扩增，1%琼脂糖凝胶电泳，结果如图1。 图1. PCR鉴定APP/PS1转基因小鼠的凝胶电泳分析结果。 M：marker；N：阴性对照；P：阳性对照；1,2,3,4,5号为APP/PS1转基因阳性小鼠

1、宗园媛，王晓映，王海林，刘亚莉，黄澜，马春梅，张连峰，秦川. APP/PS双转基因阿尔茨海默病小鼠模型的老年斑及行为学动态分析[J]. 中国比较医学杂志. 2008. 18(9). 2、宋楠，张玲，陈巍，张倩，韩云林，秦川. 矢车菊素-3-葡萄糖苷对APPswe/PS1ΔE9阿尔茨海默病模型小鼠糖脂代谢的影响[J]. 中国比较医学杂志. 2016,26(7):15-23. 3、朱皓，高凯，张连峰. 阿尔兹海默病小鼠模型的磁共振影像学分析[J].中国比较医学杂志. 2012,(12):48-53. 4、史长华，张玲，陈巍，付信靖，秦川. RNA-Seq 技术筛选APP/PS1阿尔茨海默病模型小鼠差异表达基因及功能分析[J].中国比较医学杂志. 2018,28(10):1-7. 5、梁良. 中药I号方对阿尔兹海默病的多靶位治疗作用[J].中国比较医学杂志. 2013,23(5). 6、秦川，吴善球，陈保生，吴小闲，屈焜耀，刘军民，张桂芳，徐艳峰，舒顺利，孙丽华，李彦红，朱华，黃澜，马春梅，徐玉环，韩云林，卢耀增. 灵芝制剂治疗APP/PS-1阿尔茨海默病转基因小鼠模型的病理学改变[J].中国医学科学院学报. 2017年第4期. 7、Ling Zhang, Ying Wang, Xia Xiayu, Changhua Shi, Wei Chen, Nan Song, Xinjing Fu, Rui Zhou, Yan-Feng Xu, Lan Huang, Hua Zhu, Yunlin Han and Chuan Qin∗. Altered Gut Microbiota in a Mouse Model of Alzheimer’s Disease[J]. Journal of Alzheimer’s Disease 60 (2017) 1241–1257. 8、Yan Liu, Yan-Feng Xu, Ling Zhang, Lan Huang, Pin Yu, Hua Zhu, Wei Deng, Chuan Qin∗. Effective expression of Drebrin in hippocampus improves cognitive function and alleviates lesions of Alzheimer’s disease in APP (swe)/PS1 (ΔE9) mice[J]. CNS Neurosci Ther. 2017 Jul;23(7):590-604.

阿尔兹海默病（Alzheimer’s disease, AD）是最常见的神经退行性疾病，也是最常见的痴呆疾病（dementia），随年龄的增长其发病率逐渐增加。阿尔兹海默病的致病机制尚不明确，主要分为家族性阿尔兹海默病（familial AD, FAD）和散发性阿尔兹海默病（sporadic AD, sAD）。疾病的病理表现集中在神经元之间的淀粉样蛋白斑块沉积，神经元细胞内的磷酸化Tau蛋白和神经原纤维缠结，海马区和新皮层区弥散性的神经元丢失。

  图：模型制作示意图 将London/Swedish双突变APP基因插入到PDGF启动子下游，构建转基因表达载体，通过显微注射法建立APP695V652I/K596N/M597L双突变转基因C57BL/6J小鼠。用显微注射法将线性化的转基因载体注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中，转入到假孕受体ICR小鼠中。

[1] 方瑾,马春梅,黄澜,刘亚莉,宗圆媛,全雄志,李万波,秦川.London/Swedish双突变APP转基因小鼠的鉴定[J].中国比较医学杂志,2008(05):24-27+36+82.

临床症状主要为记忆障碍、失语、失用、失认、视空间技能损害、执行功能障碍以及人格和行为改变等全面性痴呆表现，起病隐匿，呈进行性发展。 病理表现主要为脑组织萎缩、神经纤维缠结、老年斑形成和大量淀粉样蛋白沉积。 发病机制尚不明确，从目前研究来看，该病的可能因素和假说多达30余种，主要发病机制假说包括Aβ毒性假说，Tau蛋白代谢异常，神经炎症，胆碱能损伤，金属离子代谢紊乱，糖脂代谢紊乱，自由基损伤，神经血管功能失调，线粒体功能紊乱，兴奋性氨基酸毒性、病毒感染等。

构建带有神经特异性启动子的质粒PrP-hAPP695K595N/M596L，用显微注射法将线性化转基因质粒注射到C57BL/6J小鼠受精卵中，以C57BL/6J小鼠作假孕受体   2、基因型鉴定 提取首建鼠后代鼠尾DNA，PCR扩增，1%琼脂糖凝胶电泳，结果如图1。 图1. PCR鉴定APPswe转基因小鼠的凝胶电泳分析结果。 1-2：阴性小鼠；3-8：APPswe转基因阳性小鼠；9：Marker；10：阳性对照   3、APP蛋白在APPswe转基因小鼠脑中的表达鉴定  免疫组化： 抗人APP抗体免疫组化染色显示转基因小鼠大脑皮层和海马神经元胞质阳性染色，神经胶质细胞及细胞间质未见阳性着色。阴性对照组小鼠皮层和海马神经元胞质染色阴性。 图2、抗人APP抗体免疫组化染色结果。 （a）APPswe转基因小鼠，（b）阴性对照鼠

1、黄澜，朱华，高虹，张兵林，刘亚莉，秦川. 不同月龄人APP老年痴呆转基因小鼠行为学观察比较[J]. 中国老年学杂志. 2004年第12期. 2、秦川，朱华，张兵林，常洋，尹红星，刘亚莉. 阿尔茨海默症转基因动物模型脑组织病理学及免疫组化研究[J]. 中国实验动物学报. 2000,8(4). 3、黄澜，朱华，高虹，张兵林，刘亚丽，秦川，张建民，孔庆力，何维. 转人APP老年痴呆病基因动物临床应用[J].医学动物防制. 2006年第6期.

阿尔兹海默病（Alzheimer’s disease, AD）是最常见的神经退行性疾病，也是最常见的痴呆疾病（dementia），随年龄的增长其发病率逐渐增加。阿尔兹海默病的致病机制尚不明确，主要分为家族性阿尔兹海默病（familial AD, FAD）和散发性阿尔兹海默病（sporadic AD, sAD）。疾病的病理表现集中在神经元之间的淀粉样蛋白斑块沉积，神经元细胞内的磷酸化Tau蛋白和神经原纤维缠结，海马区和新皮层区弥散性的神经元丢失。

质粒构建：构建含有全长突变的人APPcDNA695V717I受控于PDGF启动子调控的质粒pPDAP695。质粒pPDAP695的Tth111I+XbaI的酶切片段为4.1kb，透析袋法进行回收。氯化铯超离纯化，将含有DNA的溶液合并，在注射缓冲液中透析。 超排卵和取卵与显微注射：供卵鼠于明暗循环的明循环中点腹腔注射PMS10IU，46h后注射HCG10IU，并与公鼠合笼，次日晨将有阴栓的母鼠处死， 在膨大部划出卵团，加透明质酸酶消化，挑出受精卵于M16继续培养4小鼠。纤维注射针末端虹吸DNA溶液后，于400倍镜下注入受精卵雄性原核。

秦川,常洋,朱华,尹红星,高虹,张兵林,黄澜.老年性痴呆转基因(APP)动物模型的建立及应用[J].医学研究通讯,2004(08):21.

药物耳毒性是指药物导致的内耳损伤，这种损伤可以发生在耳蜗，前庭或/和听神经。药物耳毒性可以是可逆性的如阿司匹林等，也可导致永久性耳聋如氨 基糖苷类和一些抗癌药如卡铂，顺铂等。

1. 实验动物 野生型斑马鱼 AB 或 TU 品系 5 dpf 幼体。斑马鱼的位听觉器官由相当于哺乳动物内耳的耳囊及其附属结构构成，包括神经丘(有数个位于中心的毛细胞和围绕在周围的支持细胞构成)、半规管和两个耳囊（椭圆囊和圆囊，相当于人的卵圆窗和圆窗），其功能与人类内耳相同。另外，在斑马鱼侧线系统上的神经丘毛细胞也具有位觉功能。斑马鱼 5-dpf 幼体直到成年，其对声音的刺激域和频宽是不变的。因此，斑马鱼的位听觉器官是研究位听觉的理想模型。 2. 造模化合物及其对斑马鱼的处理 造模药：氨基糖苷类药物：庆大霉素(Gentamycin)、新霉素(Neomycin)和链霉素(Streptomycin)。三种造模药通过预实验确定给药浓度梯度。均使用人工海水直接配置。将发育至 6 hpf 的斑马鱼胚胎暴露于上述三种氨基糖苷类药液中，直至 72 hpf。撤去药液，用正常饲养液清洗斑马鱼后，继续发育至 5、6 dpf，进行后续处理。 3. 模型分析指标 （1） 症状观察 斑马鱼身体平衡失调和体位异常与其位觉功能损伤相关。正常斑马鱼的 5 dpf幼体静止时体位为俯位。斑马鱼幼体在静止时呈斜侧位，或游动姿态异常，均为体位失衡。 （2） 毛细胞损伤检测 取野生型和造模药处理的斑马鱼幼体（6 dpf），分别浸入活体荧光染料 1 μM Yo-Pro-1（Invitrogen）的人工海水中避光孵化 1 小时，将斑马鱼用人工海水洗三 次，再将胚胎置于麻醉剂 MS222 (3-aminobenzoic acid ethylester, methanesulfonate salt, Sigma) 0.1mg/ml 中，麻醉后在荧光显微镜下观察毛细胞形态、数量和排列，并拍摄、计数。 （3） 病理诊断 显微镜下观察活体幼体耳结构的变化，包括半规管和耳囊形态结构的变化。以同批野生型斑马鱼幼体为正常对照组，药物处理组撤药 2 天后，以耳石周围的 MI1、MI2、O1、O2、IO4 五个部位的神经丘毛细胞作为主要观察对象，结合侧线神经丘和毛细胞的观察、计数。以神经丘毛细胞数量减少和毛细胞结构异常为病理诊断指标。 （4）基因检测 RT-PCR 方法检测听觉发育基因的转录水平： 收集野生型和药物不同浓度处理胚胎各 40 枚, 用 Trizol 提取总 RNA; 以 AMV 反转酶反转录试剂盒(Promega 3 Co.) 合成 cDNA1st 模板；进行常规 PCR。以 β-actin 基因作为内参基因。PCR 产物电泳, 凝胶成像分析仪拍照记录。

病毒性肝炎(Viral hepatitis)是由肝炎病毒感染引起的以肝实质细胞变性、坏死为 主要病变的常见传染病。常见的肝炎病毒有甲、乙、丙、丁、戊、庚六型。丙型肝炎病毒(HCV)感染者有 70％可转变为慢性肝炎，是罹患肝细胞癌的主要人群。HCV是一种(+)链 RNA 病毒，特异性侵袭人的肝脏；HCV 在肝脏细胞内的反复大量复制、导致宿主细胞病变、不断侵染周围正常肝细胞，是导致肝炎迁延不愈、促使肝纤维化、肝硬化，直至肝癌的重要诱因。

1. HCV 亚复制子基因载体 HCV 亚复制子基因载体由两部分组成：mini-HCV genome 和 HCV-RNA 多聚酶 (NS5B)表达载体。具体构建：克隆小鼠肝脏特异的肝核因子 4a(mHNF4a)序列，并将此序列替换我们前期的 HCV 构件的 CMV 启动子，获得含有 GFP 报告基因的肝脏特异的 mini-HCV genome。克隆斑马鱼的肝型脂肪酸结合蛋白基因的增强子(L-fabpe) 和人肝脂酶启动子序列(hLP)，并与 NS5B 编码序列和报告基因 RFP 序列重组到真核细胞表达载体上，获得肝脏特异的 NS5B 表达载体。这两个基因构件结构图见图 1A。 2. 实验动物 野生型斑马鱼 AB 品系。 3. 造模 取野生型斑马鱼受精卵（1-4 cell 期），通过显微注射将 HCV 亚复制子的两个基因构件混合物(1–5 ng/ml)共注射到受精卵内。正常饲养。待胚胎发育至 4 dpf 幼体，进行后续检测。 4. 模型分析指标 （1） 症状观察 以 WT 斑马鱼为对照，观察斑马鱼幼体表型和生长的变化。 （2） 病毒检测 初筛：荧光显微镜下观察、拍摄幼体内报告基因的表达分布：在肝脏有绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白共表达的幼体，即为 HCV 亚复制子模型个体。确证：采用斑马鱼整体原位杂交实验、RT-PCR 和 Western blot 检测 HCV 亚复制子的复制和 HCV 特异的复制酶 NS5B 的表达及其肝定位。 （3） 病理诊断 HCV 基因可导致宿主体内病理变化，首先反映在相关基因表达的变化。我们采用 RT-PCR 和 Western blot 方法检测了 HCV 的效应基因如：Solute carrier family 2 (ScarF2)、Leucine-rich repeat-containing G protein coupled receptor 5 (Leugpcr)、Ras-related GTP binding D (Rasgbd)和 Argininosuccinate synthetase 1 (Argsyn)；内质网 应激和 UPR 相关基因如：chop、atf4、atf6 和 bip 基因。

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)被认为是仅次于酒精和病毒性肝炎导致肝硬化的第三大病因。NAFLD 是指除外酒精和其他明确的肝损伤因素所致的，以弥漫性肝细胞大泡性脂肪为主要特征的临床病理综合征，包括单纯性脂肪性肝病以及由其演变的脂肪性肝炎和肝硬化。肥胖、II 型糖尿病、高脂血症等单独或共同成NAFLD 的诱因。NAFLD 多伴有中心性肥胖、胰岛素抵抗和脂质代谢紊乱，也被认为是代谢综合征的一种表现。病理特征：以大泡性或以大泡性为主的肝细胞脂肪变性为特征。

1. 实验动物 野生型斑马鱼 AB 品系。 2. 造模化合物及斑马鱼处理 采用高脂、高糖、高胆固醇三种饮食方案饲喂斑马鱼幼体。具体方案见图1 （Ref.1）。主要步骤：取野生型斑马鱼幼体(5 dpf)，随机分为4组：正常饮食(30 mg/d AP100)、高胆固醇(30 mg/d AP100 plus 4% (w/w) cholesterol)、高糖(30 mg/d AP100 plus 0.25%(w/v) fructose)、高脂(180 mg/d AP100)，按照各自饮食方案饲喂10天。饲喂终止后，空腹过夜，收集幼体进行后续实验检测。为了观察胆固醇在体内的分布，在4组食物中添加BODIPY 标记的胆固醇(10μg/g cholesterylBODIPY 542/563-C11, Invitrogen)。 3. 模型分析指标 （1） 症状观察 观察和拍照斑马鱼表型；测量斑马鱼幼体体长和称重，统计学处理并比较 4组数据。 （2） 病理检测 A. 对斑马鱼整体进行油红染色，检测体内脂质蓄积水平和分布；荧光显微镜下观察 BODIPY 标记的胆固醇在体内的分布和强度。B. 肝脏冰冻切片和油红 O 染色；C. 肝脏石蜡切片和 H.E 染色。 （3） 病理诊断 采用肝脏组织切片和 HE 染色检测，以脂质/胆固醇在肝脏蓄积、或以大泡性为主的肝细胞脂肪变性为特征。

白血病是一类造血干细胞的恶性克隆性疾病，其特点是在骨髓和其他造血组织中 白血病细胞广泛而无控制地增生，并浸润、破坏全身各组织器官。造血细胞的某一系列、主要是某一白细胞系列的前体细胞失去分化成熟能力，在骨髓中和其他造血组织中呈恶性克隆性增生、积聚，并侵犯肝、脾、淋巴结，最终浸润破坏全身组织、器官，使正常造血功能受到抑制。白血病会导致正常造血功能受抑制，外周血出现幼稚细胞。

1. ddx18 基因敲除斑马鱼的制备 委托基因公司采取基因编辑技术制备 ddx18 基因敲除的 F0 代杂合子斑马鱼 3 条。 2. ddx18 基因敲除斑马鱼的验证 将获得的 F0 代杂合子斑马鱼进行交配，获得 F1 代胚胎。将 F1 胚胎按常规饲养至性成熟，取 3-4 月龄的 F1 成鱼，编号、剪取部分尾鳍，提取基因组 DNA，克隆相关基因片段、测序鉴定基因型，筛选基因组 ddx18 敲除的突变体。 3. 携带 ddx18 突变等位基因的 F2 突变体的筛选鉴定 将 ddx18 敲除的 F1 代雌雄斑马鱼继续交配，获得 F2 代，待其性成熟后，同上，取 F2 代成体斑马鱼少量尾鳍，提取基因组 DNA，利用 ddx18 特异性引物进行 PCR扩增，测序鉴别 ddx18 敲除成功的斑马鱼进一步繁殖、或用于后续实验。Ddx18 基因表达检测：根据该基因 mRNA 设计引物，取 F2 代幼体，采用 RT-PCR 检测 ddx18 基因转录产物，并测序验证其产物突变或缺失。 4. 模型分析指标 （1）外周血涂片检测 ddx18 基因缺失对血液细胞类型的影响 取 3-4 月龄野生型和 ddx18 基因缺失的斑马鱼外周血涂片、瑞氏-姬姆萨复合染液染色，进行非红细胞分类计数（包括原始粒细胞、幼稚粒细胞、杆状中性粒细胞、分叶中性粒细胞、血栓细胞、淋巴细胞和单核细胞）和细胞形态分析。 （2）免疫印迹计数检测 ddx18 基因缺失对斑马鱼血液发生标志蛋白的影响 取不同“家系”的 ddx18 敲除的斑马鱼幼体（5 dpf）（野生型 5 dpf 斑马鱼幼体做对照），提取总蛋白，Western Blot 检测血液发生标志蛋白 C-myb，Thrombopoietin，G-CSF，CD41 蛋白水平。

人急性白血病是一类造血干细胞的恶性克隆性疾病。外周血可见数量不等 的原始和幼稚细胞，约 50％的患者血小板低于正常值，晚期血小板往往极度减 少。发病时骨髓中异常的原始细胞及幼稚细胞（白血病细胞）大量增殖并抑制正 常造血，广泛浸润肝、脾、淋巴结等各种脏器。表现为贫血、出血、感染和浸润 等现象。其发病因素：1.生物因素：病毒感染和免疫功能异常；2.物理因素：电 离辐射；3.化学因素：长期接触化学物质如苯类化合物、一些药物如乙亚胺类化 合物、抗肿瘤药物烷化剂和拓扑异构酶 II 抑制剂等有致白血病作用。4.遗传因 素：家族性白血病约占白血病的千分之七。临床症状有：突然高热、出血、紫癜、脸色苍白，凝血异常。

1. 实验动物 野生型斑马鱼 AB 或 TU 品系。 2. 造模化合物 二乙基亚硝胺 (Diethylnitrosamine, DEN)。 3. 模型分析指标 （1） 检测方法 将斑马鱼成体暴露于 200 μg/ml 的 DEN 溶液中 4 天，洗涤后，心脏取血，涂片、固定、用瑞氏-姬姆萨染色液染色，显微镜下观察、拍摄。进行血细胞分类计数、血涂片细胞形态学的观察。 （2） 病理诊断 常规血液病的最后确诊有赖于实验室检查：血细胞分类计数和血涂片细胞形态学的观察等。以血涂片分类检测到原始和幼稚细胞、血栓细胞减少为诊断指标。  

心肌病是一类以伴有心功能障碍的心肌病变为主要表现的疾病。临床上分为 四型，主要表现为心腔扩大、心肌肥大、心电图 ST-T 改变，心功能不全等。T 波低平或倒置，见于心肌损伤，心肌缺血，低血钾等。药源性心肌病是指因使用 药物如阿霉素（adriamycin, ADR）等蒽环类抗癌药物等药物，发生药物性心肌 病(drug-induced cardiomyopathy)。其临床表现为心律失常，室内传导阻滞，ST-T 改变，慢性心功能不全等，类似扩张型心肌病或非梗阻性肥厚型心肌病的症状和 体征。

1. 造模化合物 阿霉素（adriamycin, ADR 或 DOX） 2. 实验动物 野生型斑马鱼 AB 或 TU 品系。 3. 造模化合物及其给药处理 阿霉素，根据预实验确定给药浓度。取正常发育的斑马鱼胚胎(6 hpf), 30 枚/组，WT 组为无药处理组，分别给予 1、5、10 μM 浓度的阿霉素至 72 hpf；显微镜下观察心脏结构和形态，或进行其它检测。 随机取成体斑马鱼，15 条/组，WT 组为无药处理组，分别给予 1、5、10 μM2浓度的阿霉素，持续 7 天给药。进行心电图检测。 4. 模型分析指标 （1） 症状观察 显微镜下观察活体斑马鱼幼体心脏结构：心腔结构和形态变化、心包大小、射血是否顺畅和有力等。 （2） 病理诊断 阿霉素与心肌的亲和力高于身体其他组织，具有药物蓄积性和剂量依赖性心肌毒性。阿霉素急性心脏毒性主要表现为心电图的改变，如低电压、T 波改变、ST-T 段下降、QRT 延长及窦性心动过速等。T 波低平或倒置，见于心肌损伤，心肌缺血，低血钾等。

帕金森疾病是中老年人的慢性神经系统退行性疾病，发病年龄在 40－70 岁 之间。PD 发病与以下因素相关：1.脑老化，随人的增龄，黑质多巴胺能神经元 不断死亡，当 80％的神经元死亡时可出现 PD 症状。2. 具有遗传性，a-突触核蛋 白及 Parkin 等基因突变与少数家族性 PD 相关。3.环境因素，一些外源性或内源 性毒素可引起黑质纹状体神经元死亡，如海洛因吸食者出现 PD 样症状，后者被 证实含有神经毒素 MPTP。4. 其它疾病和外伤导致的脑神经损伤，如脑梗等脑 血管病变和创伤导致的脑神经元死亡。

1. 造模化合物 1-甲基－4－苯基－1，2，3，6－四氢吡啶（MPTP）是一种神经毒素，常用 于制作帕金森病动物模型。 2. 实验动物 野生型斑马鱼 AB 或 TU 品系。斑马鱼饲养和管理均按照常规方法。饲养空 间温度 28-30°C。 3. 造模化合物处理 MPTP 为 Sigma (M0896) 产品，MPTP 母液用纯水制备，浓度为100 µM， 储存于－20 °C. MPTP工作液用饲养液稀释至50、100、200、500 µM。将斑马鱼幼体暴露于MPTP 工作液24小时，收集幼体，进行下一步处理。 4. RT-PCR检测PD相关基因转录水平 收集斑马鱼于 TRIzol reagent (Sigma).提取总 RNA，进行 RT-PCR 检测 PD 相关的基因表达水平。PCR 引物见表 1。 表 1. Primer pairs and parameters of PCR in the study   5. 原位RNA杂交 收集斑马鱼于4% paraformaldehyde固定。Th基因探针片段为PCR产物（表1）， 并被克隆到载体pGEM-T质粒上。探针的合成按照试剂盒(DIG RNA labeling kit (Roche Applied Science, 1175041)）说明制备th基因RNA杂交探针。按照操作程序 将斑马鱼样本与探针温育、检测、拍照。 6. 原位免疫荧光检测 按照常规程序，将斑马鱼幼体与TH蛋白单克隆抗体(Minipore, MAB318)温 育，然后用FITC-标记的二抗温育、洗涤，显微镜下检测、拍照。 7. Western blotting 用RIPA lysis kit (Applygen Technologies Inc., C1053)提取斑马鱼总蛋白，进 行SDS-PAGE、转膜，用PD相应蛋白的抗体和二抗进行检测。β-ACTIN抗体，mouse anti-human ACTB antibody (Zhongshan Goldbridge, TA09); 小鼠 anti-GAPDH mAb (Zhongshan Goldbridge, TA08); 兔anti-mouse TH monoclonal antibody (Minipore, MAB318); PINK1 (D8G3) 兔mAb antibody (CST, catalog no. 6946); Parkin mAb antibody (CST, catalog no. 4211); β-syn (Syn205) 小鼠mAb antibody (CST, catalog no. 2644)。 8. 斑马鱼行为学实验 幼体行为记录采用ZebraLab (法国Viewpoint, ZebraLab 3.3)仪器，幼体逐个放 入96-孔板，(1 fish/well). 记录运动距离、游泳持续时间、速度和游泳轨迹。每5 分钟记录一次数据。