1. ddx18 基因敲除斑马鱼的制备

委托基因公司采取基因编辑技术制备 ddx18 基因敲除的 F0 代杂合子斑马鱼 3 条。

2. ddx18 基因敲除斑马鱼的验证

将获得的 F0 代杂合子斑马鱼进行交配，获得 F1 代胚胎。将 F1 胚胎按常规饲养至性成熟，取 3-4 月龄的 F1 成鱼，编号、剪取部分尾鳍，提取基因组 DNA，克隆相关基因片段、测序鉴定基因型，筛选基因组 ddx18 敲除的突变体。

3. 携带 ddx18 突变等位基因的 F2 突变体的筛选鉴定

将 ddx18 敲除的 F1 代雌雄斑马鱼继续交配，获得 F2 代，待其性成熟后，同上，取 F2 代成体斑马鱼少量尾鳍，提取基因组 DNA，利用 ddx18 特异性引物进行 PCR扩增，测序鉴别 ddx18 敲除成功的斑马鱼进一步繁殖、或用于后续实验。Ddx18 基因表达检测：根据该基因 mRNA 设计引物，取 F2 代幼体，采用 RT-PCR 检测 ddx18 基因转录产物，并测序验证其产物突变或缺失。

4. 模型分析指标

（1）外周血涂片检测 ddx18 基因缺失对血液细胞类型的影响
取 3-4 月龄野生型和 ddx18 基因缺失的斑马鱼外周血涂片、瑞氏-姬姆萨复合染液染色，进行非红细胞分类计数（包括原始粒细胞、幼稚粒细胞、杆状中性粒细胞、分叶中性粒细胞、血栓细胞、淋巴细胞和单核细胞）和细胞形态分析。

（2）免疫印迹计数检测 ddx18 基因缺失对斑马鱼血液发生标志蛋白的影响

取不同“家系”的 ddx18 敲除的斑马鱼幼体（5 dpf）（野生型 5 dpf 斑马鱼幼体做对照），提取总蛋白，Western Blot 检测血液发生标志蛋白 C-myb，Thrombopoietin，G-CSF，CD41 蛋白水平。

1. 外周血涂片检测 ddx18 基因缺失对血液白细胞类型的影响

取 WT 和 DDX18 敲除的斑马鱼成鱼外周血涂片，进行非红细胞分类计数和细胞形态分析（图 1 A、1C）。基因 ddx18 缺失的斑马鱼外周血细胞与正常鱼比较，原始粒细胞和幼稚粒细胞明显增多，血栓细胞略有减少（图 1 B，图 1 D），表明 ddx18 敲除的斑马鱼具有髓系白血病的特征。

2. 免疫印迹方法检测 ddx18 基因缺失对斑马鱼血液发生标志蛋白的影响

以 WT 型斑马鱼为对照，检测血细胞发育相关基因，结果显示，敲除 ddx18 基因后，限定性血液干细胞(Definitive HSC)标志蛋白 C-MYB 和 CD41 和血栓细胞标志蛋白 TPO 水平明显升高，而髓系标志蛋白 G-CSF 的短型同源物缺失（图 2）。这些结果证明 ddx18 基因缺失可影响髓系早期血细胞的发育。

图 1. 野生型与 ddx18 基因敲除斑马鱼血细胞形态学分析

A: 野生型斑马鱼外周血细胞分型; B：野生型斑马鱼外周血细胞分类计数；C: ddx18 基因敲

除斑马鱼外周血细胞分型；D：ddx18 基因敲除斑马鱼的外周血细胞分类计数。

图 2. 野生型与 ddx18 基因敲除斑马鱼的血细胞标志蛋白