斑马鱼(Zebrafish, Danio rerio) AB。

1. HCV 亚复制子基因载体

HCV 亚复制子基因载体由两部分组成：mini-HCV genome 和 HCV-RNA 多聚酶 (NS5B)表达载体。具体构建：克隆小鼠肝脏特异的肝核因子 4a(mHNF4a)序列，并将此序列替换我们前期的 HCV 构件的 CMV 启动子，获得含有 GFP 报告基因的肝脏特异的 mini-HCV genome。克隆斑马鱼的肝型脂肪酸结合蛋白基因的增强子(L-fabpe) 和人肝脂酶启动子序列(hLP)，并与 NS5B 编码序列和报告基因 RFP 序列重组到真核细胞表达载体上，获得肝脏特异的 NS5B 表达载体。这两个基因构件结构图见图 1A。

2. 实验动物

野生型斑马鱼 AB 品系。

3. 造模

取野生型斑马鱼受精卵（1-4 cell 期），通过显微注射将 HCV 亚复制子的两个基因构件混合物(1–5 ng/ml)共注射到受精卵内。正常饲养。待胚胎发育至 4 dpf 幼体，进行后续检测。

4. 模型分析指标

（1） 症状观察

以 WT 斑马鱼为对照，观察斑马鱼幼体表型和生长的变化。

（2） 病毒检测

初筛：荧光显微镜下观察、拍摄幼体内报告基因的表达分布：在肝脏有绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白共表达的幼体，即为 HCV 亚复制子模型个体。确证：采用斑马鱼整体原位杂交实验、RT-PCR 和 Western blot 检测 HCV 亚复制子的复制和 HCV 特异的复制酶 NS5B 的表达及其肝定位。

（3） 病理诊断

HCV 基因可导致宿主体内病理变化，首先反映在相关基因表达的变化。我们采用 RT-PCR 和 Western blot 方法检测了 HCV 的效应基因如：Solute carrier family 2 (ScarF2)、Leucine-rich repeat-containing G protein coupled receptor 5 (Leugpcr)、Ras-related GTP binding D (Rasgbd)和 Argininosuccinate synthetase 1 (Argsyn)；内质网 应激和 UPR 相关基因如：chop、atf4、atf6 和 bip 基因。

1. 动物症状

所建 HCV 亚复制子模型为 HCV 基因暂态表达模型，未检测到对斑马鱼发育和生长的影响。

2. 模型鉴定

斑马鱼整体的荧光显微镜检测报告基因表达和原位杂交实验均检测到 HCV RNA多聚酶（NS5B）/基因和 HCV core 蛋白/基因在肝脏的特异性表达（图 1A-D）。以 WT型斑马鱼、单独表达 NS5B 和单独表达 HCV-core 反义模板的三组斑马鱼为对照，采用 RT-PCR 和 Western blot 检测，结果显示 NS5B 和 CORE 的基因和蛋白的共表达只出现在 HCV 亚复制子斑马鱼体内（图 1E，1F），证明所建模型的可信性和有效性。

图 1. 斑马鱼肝脏特异性的 HCV 亚复制子模型

A. HCV 亚复制子基因构件示意图；B. 荧光显微镜检测 HCV-NS5B 基因在斑马鱼幼体(4 dpf)肝区特异性表达，红色荧光代表 NS5B 蛋白(556 nm excitation, 586 nm emission); C.一条 HCV 亚复制子幼体分别在白光、蓝色激发光和绿色激发光下的图像，显示 HCV 亚复制子基因组在肝区的复制，以绿色荧光代表 HCV-CORE 蛋白的 (480 nm excitation, 505 nm emission)；红色荧光代表NS5B 蛋白。D. 幼体原位杂交(WISH)结果，显示 HCV mini-RNA 基因组在肝区表达。标尺：150μm。 E.RT-PCR 检测 HCV core 和 ns5b 基因的表达；在此只有 HCV mini-genome 被复制后才能检测到 core 基因。F. Western blotting 验证 HCV CORE 和 NS5B 蛋白同时在 HCV 亚复制子幼体内表达，而不可同时出现在其它对照组。

3. 病理改变

HCV病毒在宿主细胞内的复制可以导致宿主相关基因表达水平的变化，如HCV效应基因：ScarF2、Leugpcr、Rasgbd和Argsyn。我们的检测结果表明，这些基因在HCV亚复制子幼体内的表达水平均高于野生型斑马鱼(图2A)，证明所建HCV亚复制子模型具有全病毒的一些病理特征。进一步检测内质网应激和UPR相关基因，如chop、atf4、atf6和bip基因也均高于野生型斑马鱼(图2B)。这些基因均与病毒性肝细胞炎性病变相关。

图 2. RT-PCR 检测 HCV 感染相关的宿主基因表达变化(8 dpf)

A. HCV 效应基因 ScarF2、Leugpcr、Rasgbd 和 Argsyn 的转录水平；B. UPR 标志基因 chop、atf4、atf6 和 bip 的转录水平。*p < 0.05; **p < 0.001。