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CSTR:16397.09.0I01000234 心肌组织特异性过表达LMNAE82K转基因小鼠 B6.Tg(α-MHC-LMNA E82K)-GC/ILAS

LMNA(lamin A/C )决定细胞核的大小及形状,与细胞核的稳定性、染色质结构以及基因表达有关。LMNA参与有丝分裂,被认为是构成染色质的重要成分,参与基因的表达调控。该转基因小鼠表现出扩张型心肌病病理表型。

扩增并经测序比对正确的LMNAE82K突变片段插入α-MHC启动子下游构建心脏特异表达LMNAE82K表达载体。用显微注射法将线性化的转基因载体注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中,用ICR小鼠作假孕受体,制备转基因小鼠。PCR法鉴定小鼠基因型,Western Blot分析LMNAE82K突变蛋白的表达情况(图1)。   图1. LMNAE82K转基因小鼠模型的建立及鉴定 注:将LMNAE82K突变基因片段插入α-MHC心脏组织特异性启动子下游构建转基因表达载体(A), PCR法鉴定小鼠基因型(B), M: 分子量标记; 1: 阳性对照; 2: 阴性对照; 3: 空白对照;  5,6: LMNAE82K阳性转基因小鼠; 4,7: 阴性转基因小鼠. Western Blot分析LMNAE82K突变蛋白表达(C). WT: 同龄阴性对照小鼠; F030: 首建鼠30号; F035: 首建鼠35; GAPDH: 内参.  

1.Dan Lu, Hong Lian, Xiaojuan Zhang, Haitao Shao, Lan Huang, Chuan Qin, Lianfeng Zhang. LMNA E82K Mutation Activates FAS and Mitochondrial Pathways of Apoptosis in Heart Tissue Specific Transgenic Mice. PLoS ONE. 2010 Dec 6; 5(12): e15167. 2.Lu D, Ma Y, Zhang W, Bao D, Dong W, Lian H, Huang L, Zhang L. Knockdown of Cytochrome P450 2E1 Inhibits Oxidative Stress and Apoptosis in the cTnTR141W Dilated Cardiomyopathy Transgenic Mice. Hypertension. 2012 Jul; 60(1): 81-89.

CSTR:16397.09.0I01000232 心肌组织特异性过表达Lrp2bp转基因小鼠 B6.Tg(α-MHC-m-Lrp2bp)-GC/ILAS

Lrp2bp (The low-density lipoprotein receptor related 2- binding protein) 是一个含有158个氨基酸残基的肽段,具有保守的锚蛋白重复结构域,是信号通路中蛋白-蛋白相互作用最重要的蛋白元件之一。人Lrp2bp主要在人睾丸、小肠、结肠和血白细胞中表达,是一种新型的具有四肽重复序列的支架蛋白,功能尚不十分明确。该转基因小鼠可用于Lrp2bp在心血管系统生物学作用相关研究。

扩增并经测序比对正确的Lrp2bp片段插入α-MHC启动子下游构建心脏特异表达Lrp2bp表达载体。用显微注射法将线性化的转基因载体注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中,用ICR小鼠作假孕受体,制备转基因小鼠。Western blot法鉴定蛋白表达情况(图1)。 图1 心肌组织特异性过表达Lrp2bp小鼠的表达载体构建及PCR鉴定

1.张丽,全雄志,董伟,王书美,张晓娟,葛文平,高珊,张连峰. 低密度脂蛋白受体相关蛋白2结合蛋白在心脏特异转基因小鼠中引起的心脏功能代偿. 中国实验动物学报,2010,18(2):131-135.

CSTR:16397.09.0I01000231 心肌组织特异性过表达Hepc1转基因小鼠 B6.Tg(α-MHC-m-Hepc1)-GC/ILAS

Hepc1(Hepcidin)是由肝脏特异表达的小分子防御性抗菌肽, 此外,该基因编码的产物参与了铁稳态的维持,是巨噬细胞铁储存的调节和肠道铁吸收所必需的。该基因突变导致2B型血色素沉着症,也被称为少年血色素沉着症,这是一种由严重的铁超载引起的疾病,可导致心肌病、肝硬化和内分泌衰竭。该转基因小鼠可用于Hepc1在心血管系统生物学作用相关研究。

扩增并经测序比对正确的Dhcr24片段插入α-MHC启动子下游构建心脏特异表达Dhcr24表达载体。用显微注射法将线性化的转基因载体注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中,用ICR小鼠作假孕受体,制备转基因小鼠。 图1  心肌组织特异性过表达Hepc1转基因小鼠载体构建及表达鉴定

1.张丽,张连峰. Hepcidin研究进展[J]. 中国比较医学杂志, 2010, 20(1):52-56. 2.Zhang L, Lu D, Zhang W, Quan X, Dong W, Xu Y, Zhang L. Cardioprotection by Hepc1 in cTnT(R141W) transgenic mice. Transgenic Res. 2012 Aug; 21(4): 867-878.

CSTR:16397.09.0I01000224 心肌组织特异性过表达Dhcr24转基因小鼠 B6.Tg(α-MHC-m-Dhcr24)-GC/ILAS

Dhcr24 (24-dehydrocholesterol reductase)。该基因编码黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)依赖的氧化还原酶,在胆固醇生物合成过程中催化甾醇中间体的delta-24双键的还原。胆固醇是细胞膜的重要组成部分,也是细胞转导信号时必不可少的重要物质,人类中该基因的变异能导致罕见的多组织先天异常综合症。该转基因小鼠可用于Dhcr24对心血管系统的生物学功能相关研究。

扩增并经测序比对正确的Dhcr24片段插入α-MHC启动子下游构建心脏特异表达Dhcr24表达载体。用显微注射法将线性化的转基因载体注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中,用ICR小鼠作假孕受体,制备转基因小鼠。Western blot法鉴定蛋白表达情况(图1)。   图1. 心肌组织特异性过表达Dhcr24表达载体构建

1.宋铭晶, 董伟, 全雄志,施海霞,黄澜,张连峰. 心脏特异表达Dhcr24转基因小鼠的建立和表型分析[J]. 中国比较医学杂志, 2008, 18(5):1-4. 2.Wei Dong, Feifei Guan, Xu Zhang, Shan Gao, Ning Liu, Wei chen, Lianfeng Zhang, Dan Lu. Dhcr24 activates the PI3K/Akt/HKII pathway and protects against dilated cardiomyopathy in mice. Animal Model Exp Med. 2018 Apr 19;1(1):40-52. doi: 10.1002/ame2.12007. eCollection 2018 Mar.

CSTR:16397.09.0I01000222 心肌组织特异性过表达CT-1转基因小鼠 B6.Tg(α-MHC-h-CT-1)-GC/ILAS

心肌营养素-1(cardiotrophin-1, CT-1)属于IL-6细胞因子家族。CT-1存在于多种组织中,是一种具有广谱生物学活性的细胞因子,作为一种多效性细胞因子,CT-1不仅对心脏产生多种影响,在神经系统还具有类似于其它神经营养因子的生物学作用。

扩增并经测序比对正确的CT-1片段插入α-MHC启动子下游构建心脏特异表达CT-1表达载体。用显微注射法将线性化的转基因载体注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中,用ICR小鼠作假孕受体,制备转基因小鼠。PCR法鉴定小鼠基因型(图1)。 图1. 心肌组织特异性过表达CT-1表达载体构建

1.吕丹, 张连峰.心肌营养素-1在心脏发育和心脏病发生中的作用[J].中国分子心脏病学杂志,2008, 8 (1): 55-59. 2.吕丹, 张连峰.心肌营养素-1生物学功能的多样性[J].中国比较医学杂志,2008, 18(5): 16-20.

CSTR:16397.09.0I01000222 心肌组织特异性过表达Wif-1转基因小鼠 B6.Tg(α-MHC-m-Wif-1)-GC/ILAS

Wif-1通过直接与Wnt蛋白相连,从而阻止Wnt与受体蛋白复合物相连,使细胞质中的β-catenin由于磷酸化而不能积累,进而阻断了经典和非经典Wnt通路。该转基因小鼠可用于Wif-1对心血管系统的生物学功能相关研究。

扩增并经测序比对正确的Wif-1片段插入α-MHC启动子下游构建心脏特异表达Wif-1表达载体。用显微注射法将线性化的转基因载体注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中,用ICR小鼠作假孕受体,制备转基因小鼠。PCR法鉴定小鼠基因型(图1)。 图1  Wif-1转基因表达载体及蛋白水平表达鉴定

1.Lu D, Dong W, Zhang X, Quan X, Bao D, Lu Y, Zhang L. WIF1 causes dysfunction of heart in transgenicmice. Transgenic Res. 2013 Dec; 22(6): 1179-1189.

CSTR:16397.09.0I01000221 心肌组织特异性过表达HB-EGF转基因小鼠 B6.Tg(α-MHC-m-HB-EGF)-GC/ILAS

Hbegf (heparin-binding EGF-like growth factor),HB-EGF信号对于心脏发育和维持是必需的。在心肌肥大或心肌梗死等情况下HB-EGF表达增高。该转基因小鼠可引起心肌纤维化等表型,可用于HB-EGF对心血管系统的生物学功能相关研究。

扩增并经测序比对正确的HB-EGF片段插入α-MHC启动子下游构建心脏特异表达HB-EGF表达载体。用显微注射法将线性化的转基因载体注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中,用ICR小鼠作假孕受体,制备转基因小鼠(图1)。

1.彭健豪, 张连峰. 肝素结合性表皮生长因子(HB-EGF)在心脏发育中的作用[J]. 中国比较医学杂志, 2005,15(4):217-217. 2.彭健豪,邸冉,董伟,张连峰. 肝素结合性表皮生长因子转基因小鼠的建立和功能研究[J]. 中国比较医学杂志, 2007,17(4):187-191. 3.Hong Lian, Yuanwu Ma, Juan Feng, Wei Dong, Qing Yang, Dan Lu, Lianfeng Zhang. Heparin-Binding EGF-like Growth Factor Induces Heart Interstitial Fibrosis via an Akt/mTor/p70s6k Pathway. PLoS ONE. 2012 Sep 12; 7(9): e44946. 4.S. Higashiyama, J.A. Abraham, J. Miller, et al. J.C. Fiddes, M. Klagsbrun, A heparin-binding growth factor secreted by macrophage-like cells that is related to EGF, Science 251 (1991) 936-939. 5.R. Iwamoto, S. Yamazaki, M. Asakura, S. et al. Heparin-binding EGF-like growth factor and ErbB signaling is essential for heart function, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100 (2003) 3221-3226. 6.K. Elenius, S. Paul, G. Allison, J. Sun, et al. M. Klagsbrun, Activation of HER4 by heparin-binding EGF-like growth factor stimulates chemotaxis but not proliferation, EMBO J. 16 (1997) 1268-1278. 7.E. Nishi, A. Prat, V. Hospital, et al. K. Elenius, M. Klagsbrun, N-arginine dibasic convertase is a specific receptor for heparin-binding EGF-like growth factor that mediates cell migration, EMBO J. 20 (2001) 3342-3350. 8.N. Prenzel, E. Zwick, H. Daub, M. et al. EGF receptor transactivation by G-protein-coupled receptors requires metalloproteinase cleavage of proHB-EGF, Nature 402 (1999) 884-888. 9.B. Pan, K. Sengoku, K. Goishi, N. et al. The soluble and membrane-anchored forms of heparin-binding epidermal growth factor-like growth factor appear to play opposing roles in the survival and apoptosis of human luteinized granulosa cells, Mol. Hum. Reprod. 8 (2002) 734-741. 10.D. Nanba, Y. Kinugasa, C. Morimoto, M. Koizumi, H. et al. Loss of HB-EGF in smooth muscle or endothelial cell lineages causes heart malformation, Biochem. Biophys. Res. Commun. 350 (2006) 315-321.

CSTR:16397.09.0I01000220 心肌组织特异性过表达Dkk3转基因小鼠 B6.Tg(α-MHC-m-Dkk3)-GC/ILAS

Dkk3 (dickkopf homolog 3),Dkks基因编码分泌性Wnt拮抗剂的一个小家族,Wnts家族信号通路参与细胞活动、极性及粘性等变化,在细胞增殖、分化及肿瘤的形成等过程发挥重要作用。该转基因小鼠可用于Dkk3对心血管系统的生物学功能相关研究。

扩增并经测序比对正确的Dkk3片段插入α-MHC启动子下游构建心脏特异表达Dkk3表达载体。用显微注射法将线性化的转基因载体注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中,用ICR小鼠作假孕受体,制备转基因小鼠。PCR法鉴定小鼠基因型(图1)。   图1  Dkk3 转基因表达载体

1.吕丹,董伟,陈炜,张丽,张伟,赵海平,秦川,张连峰.Dkk3心脏特异表达转基因小鼠心脏功能分析[J].中国比较医学杂志,2009, 19(5): 16-19. 2.Lu D, Bao D, Dong W, Liu N, Zhang X, Gao S, Ge W, Gao X, Zhang L. Dkk3 prevents familial dilated cardiomyopathy development through Wnt pathway. Lab Invest. 2016 Feb; 96(2):239-48. Lu D, Bao D, Dong W, Liu N, Zhang X, Gao S, Ge W, Gao X, Zhang L. Dkk3 prevents familial dilated cardiomyopathy development through Wnt pathway. Lab Invest. 2016 Feb; 96(2):239-48.

CSTR:16397.09.0I01000219 心肌组织特异性过表达cTnIR145G转基因小鼠 B6.Tg(α-MHC-h-cTnI R145G)-GC/ILAS

cTnI (cardiac troponin I) 是抑制亚基,其可阻断肌动蛋白-肌球蛋白的相互作用,从而介导横纹肌松弛。该基因编码的蛋白仅在心肌组织中表达。肌钙蛋白I在诊断心力衰竭和缺血性心脏病方面应用较广。该基因R145G突变转基因小鼠,表现为肥厚型心肌病临床患者病理表型。

扩增并经测序比对正确的cTnIR145G突变片段插入α-MHC启动子下游构建心脏特异表达cTnIR145G表达载体。用显微注射法将线性化的转基因载体注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中,用ICR小鼠作假孕受体,制备转基因小鼠。PCR法鉴定小鼠基因型,Western Blot分析cTnIR145G突变蛋白的表达情况(图1)。   图1. cTnIR145G转基因小鼠模型的建立及鉴定 注:将cTnIR145G突变基因片段插入α-MHC心脏组织特异性启动子下游构建转基因表达载体(A). PCR法鉴定小鼠基因型(B), M: 分子量标记; 1: 阳性对照; 2: 阴性对照; 3: 空白对照;  5,8: cTnIR145G阳性转基因小鼠; 4,6,7: 阴性转基因小鼠. Western Blot分析cTnIR145G突变蛋白表达(C), WT: 同龄阴性对照小鼠; F028, 24, 4, 45: 首建鼠28,24,4,45号; GAPDH: 内参,灰度扫描定量分析蛋白表达情况(D).  

1.邵海涛, 张丽, 向志光, 陈炜, 张晓娟, 曹兴水, 吕丹.心脏特异表达cTnIR145G转基因小鼠的建立及表型分析[J].中国分子心脏病学杂志,2011,11 (1): 42-46.

CSTR:16397.09.0I01000218 心肌组织特异性过表达cTnTR141W转基因小鼠 B6.Tg(α-MHC-h-cTnT R141W)-GC/ILAS

TNNT2 (troponin T2, cardiac type),又名cTnT。该基因编码的蛋白是肌钙蛋白复合体的原肌凝蛋白结合亚基,位于横纹肌的细丝上,并根据细胞内钙离子浓度的变化调节肌肉收缩。该基因突变与家族性肥厚型心肌病和扩张型心肌病有关。该基因R141W突变转基因小鼠,表现为扩张型心肌病临床患者病理表型。

扩增并经测序比对正确的cTnTR141W突变片段插入α-MHC启动子下游构建心脏特异表达cTnTR141W表达载体(图1A)。用显微注射法将线性化的转基因载体注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中,用ICR小鼠作假孕受体,制备转基因小鼠。PCR法鉴定小鼠基因型(图1B),Northern Blot法分析cTnTR141W的表达情况(图2)。   图1. cTnTR141W转基因小鼠模型的建立及鉴定 注:(A) 将cTnTR141W突变基因片段插入α-MHC心脏组织特异性启动子下游构建转基因表达载体. (B) PCR法鉴定小鼠基因型. 1: 阳性对照;2: 分子量标记;20:阴性对照;21:空白对照;3,15,18: cTnTR141W阳性转基因小鼠;其余为阴性转基因小鼠.   图2. Northern Blot法分析cTnTR141W转基因小鼠心肌组织cTnT的表达 (A)Northern Blot法观察内源及转基因外源cTnT基因RNA的表达情况. (B) PCR法分析未经及经酶消化后cTnT的表达,1,2:野生小鼠基因组对照;3,4:首建鼠1号;5,6:首建鼠13号;7,8:首建鼠16号.

1.Juan F, Wei D, Xiongzhi Q, Ran D, Chunmei M, Lan H, Chuan Q, Lianfeng Z. The changes of the cardiac structure and function in cTnTR141W transgenic mice. Int J Cardiol. 2008 Aug 1;128(1):83-90. 2.Zhao H, Lv D, Zhang W, Dong W, Feng J, Xiang Z, Huang L, Zhang L. Ginsenoside-Rb1 attenuates dilated cardiomyopathy in cTnT(R141W) transgenic mouse. J Pharmacol Sci. 2010; 112(2): 214-222. 3.Zhao HP, Lü D, Zhang W, Zhang L, Wang SM, Ma CM, Qin C, Zhang LF. Protective action of tetramethylpyrazine phosphate against dilated cardiomyopathy in cTnT(R141W) transgenic mice. Acta Pharmacol Sin. 2010; 31(3): 281-288. 4.Zhang W, Lu D, Dong W, Zhang L, Zhang X, Quan X, Ma C, Lian H, Zhang L. Exprssion of CYP2E1 increases oxidative stress and induces apoptosis of cardiomyocytes in transgenic mice. FEBS J. 2011 May; 278(9): 1484-1492. 5.Zhang L, Lu D, Zhang W, Quan X, Dong W, Xu Y, Zhang L. Cardioprotection by Hepc1 in cTnT(R141W) transgenic mice. Transgenic Res. 2012 Aug; 21(4): 867-878. 6.Lu D, Shao HT, Ge WP, Liu N, Zhang X, Ma CM, Qin C, Zhang LF. Ginsenoside-Rb1 and Tetramethylpyrazine Phosphate Act synergistically to Prevent Dilated Cardiomyopathy in cTnTR141W Transgenic Mice. J Cardiovasc Pharmacol. 2012 May; 59(5): 426-433. 7.Lu D, Ma Y, Zhang W, Bao D, Dong W, Lian H, Huang L, Zhang L. Knockdown of Cytochrome P450 2E1 Inhibits Oxidative Stress and Apoptosis in the cTnTR141W Dilated Cardiomyopathy Transgenic Mice. Hypertension. 2012 Jul; 60(1): 81-89. 8.朱皓,吕丹,高凯,张连峰. 磁共振成像对扩张型心肌病转基因模型小鼠左右心室对比分析[J].中国实验动物学报. 2013, 21(2): 28-33. 9.Lu D, Zhang L, Bao D, Lu Y, Zhang X, Liu N, Ge W, Gao X, Li H, Zhang L. Calponin 1 inhibits dilated cardiomyopathy development in mice through the εPKC pathway. Int J Cardiol. 2014 May 1; 173(2): 146-153. 10.Lu D, Bao D, Dong W, Liu N, Zhang X, Gao S, Ge W, Gao X, Zhang L. Dkk3 prevents familial dilated cardiomyopathy development through Wnt pathway. Lab Invest. 2016 Feb; 96(2):239-48. 11.Lu D, Wang J, Li J, Guan F, Zhang X, Dong W, Liu N, Gao S, Zhang L. Meox1 accelerates myocardial hypertrophic decompensation through Gata4. Cardiovasc Res. 2018 Feb 1;114(2):300-311. 12.Wei Dong, Feifei Guan, Xu Zhang, Shan Gao, Ning Liu, Wei chen, Lianfeng Zhang, Dan Lu. Dhcr24 activates the PI3K/Akt/HKII pathway and protects against dilated cardiomyopathy in mice. Animal Model Exp Med. 2018 Apr 19;1(1):40-52. doi: 10.1002/ame2.12007. eCollection 2018 Mar.

CSTR:16397.09.0I01000217 心肌组织特异性过表达cTnTR92Q转基因小鼠 B6.Tg(α-MHC-h-cTnT R92Q)-GC/ILAS

TNNT2 (troponin T2, cardiac type),又名cTnT。该基因编码的蛋白是肌钙蛋白复合体的原肌凝蛋白结合亚基,参与调节肌肉收缩。该基因突变与家族性肥厚型和扩张型心肌病相关。该基因R92Q突变转基因小鼠,表现为肥厚性心肌病临床患者病理表型。

扩增并经测序比对正确的cTnTR92Q突变片段插入α-MHC启动子下游构建心脏特异表达cTnTR92Q表达载体。用显微注射法将线性化的转基因载体注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中,用ICR小鼠作假孕受体,制备转基因小鼠。PCR法鉴定小鼠基因型。

1.董伟,冯娟,全雄志,陈炜,祝梅香,刘亚莉,张连峰. cTnTR92Q转基因小鼠肥厚型心肌病模型的建立[J].中国比较医学杂志,2008,18(5):5-8. 2.Lu D, Dong W, Zhang X, Quan X, Bao D, Lu Y, Zhang L. WIF1 causes dysfunction of heart in transgenic mice. Transgenic Res. 2013 Dec; 22(6): 1179-1189. 3.Bao D, Lu D, Liu N, Dong W, Lu YD, Qin C, Zhang LF. Tomoregulin-1 prevents cardiac hypertrophy after pressure overload in mice by inhibiting TAK1-JNK pathways. Dis Model Mech. 2015 Aug 1; 8(8):795-804. 4.Lu D, Wang J, Li J, Guan F, Zhang X, Dong W, Liu N, Gao S, Zhang L. Meox1 accelerates myocardial hypertrophic decompensation through Gata4. Cardiovasc Res. 2018 Feb 1;114(2):300-311.

CSTR:16397.09.0C01000717 铁过载小鼠的活动性结核病模型 An iron overload TB mouse model

结核病是由结核分枝杆菌(结核菌)引起的一种慢性传染性疾病,结核感染通常会累及肺、淋巴系统及其它多组织器官。除少数发病急促外,临床上多呈慢性过程。常有低热、乏力等全身症状和咳嗽、咯血等呼吸系统表现。感染后潜伏期4~8周,其中80%发生在肺部,其他部位(颈淋巴、脑膜、腹膜、肠、皮肤、骨骼)也可继发感染。

1.1实验材料  C57BL/6N 小鼠(北京维通利华,SCXK (京)-2016-0006),右旋糖酐铁注射液(江西创导动物保健品有限公司),血清铁、铁蛋白、转铁蛋白及可溶性转铁蛋白受体检测试剂盒(酶免公司),组织铁检测试剂盒(南京建成生物工程研究所),普鲁士蓝染色试剂盒(Solarbio),结核分枝杆菌标准株 H37Rv(菌号为 93009,本室保存),中性罗氏培养管(珠海贝索生物),BACTEC MGIT 7H9 98 分枝杆菌快速培养管(BD 公司)。 1.2 实验方法 1.2.1 铁过载小鼠模型建立  6~8 周龄 SPF 级雌性 C57BL/6N 小鼠随机分成阴性对照、低剂量、中剂量和高剂量 4 个小组,实验组分别腹腔注射右旋糖酐铁3.75、7.5、15 mg/次,阴性对照组小鼠腹腔注射等体积生理盐水,3 次/周,共计 4 周。定期观察小鼠生长及精神状态,称重并记录。动物实验经本所实验动物管理和使用委员会(IACUC)批准,批准号为:ZLJ2019001。 1.2.2 血清生化指标与组织铁含量测定  建模完成后将小鼠摘眼球采血,4 ℃凝结过夜,2000 g 4 ℃离心 10 min,分离小鼠血清并检测血清铁、铁蛋白、转铁蛋白及可溶性转铁蛋白受体含量。解剖取小鼠心脏,肝脏、脾脏、肺、肾脏及小肠等组织器官,称重后加 1ml 生理盐水充分研磨并裂解组织碎片,12000 g 4 ℃离心 20 min,取上清并测定蛋白浓度。 血清生化检测按试剂盒说明书进行,组织铁测定则按试剂盒测定方法计算相同蛋白浓度下各组织铁含量。 1.2.3 铁过载小鼠 Mtb 感染 SPF 级 C57BL/6N 随机分成空白对照组、空白 Mtb 感染组、中剂量铁过载模型组和中剂量铁过载模型 Mtb 感染组,每组 6 只。其中 Mtb 感染组小鼠经尾静脉注射对数生长期 H37Rv 单细胞菌悬液 100 μl(1×10 6 CFU/ml),空白对照组注射等剂量无菌生理盐水。本所 ABSL-3 实验室(国卫 ABSL3-059) 正常饲喂, 观察并记录小鼠临床表现,感染后 4 周解剖小鼠。 1.2.4 小鼠组织荷菌量测定 ABSL-3 实验室动物解刨台中解剖感染小鼠,无菌取小鼠肺、脾和肝脏组织;拍照记录肺、脾和肝脏等器官大体病变情况,取小鼠左肺、脾头及肝小叶于生物 安全柜内称重,依次经 2%稀硫酸溶液、生理盐水漂洗 30 s,1 ml 生理盐水温和 匀浆后进行 10倍倍比稀释,分别取 10-3,10-4和 10 -5 稀释液 50 µl 均匀涂布于中 性罗氏培养管内,37℃培养 4 周,计算相应的组织器官荷菌量。另取 10 -1稀释液 500 μl 接种于 BD BACTEC MGIT 960 培养系统,通过记录报阳时间进行结核菌的快速检测。 1.2.5 组织切片 HE染色与铁染色 小鼠各组织器官,10%中性福尔马林溶液固定 48 h。组织按长轴最大横切面修块、梯度乙醇脱水、石蜡包埋并切成 5 µm 厚度切片,HE 染色后扫描载玻片并保存为 NanoZoomer 数字病理图像,不同视野下拍照并进行组织病理学分析。铁染色组织切片脱蜡至水,切片入 Perls 染液浸染 20 min,蒸馏水充分冲洗切片5 min,入核固红染色液,淡染细胞核 10 min,自来水冲洗 5 s。常规脱水透明,中性树胶封固,晾干后拍照观察其病理形态改变及铁沉积程度。 1.3 统计学分析   SPSS16.0 进行统计学处理,结果以平均数±标准差表示。不同实验处理组之间差异比较采用单因素方差分析,P < 0.05 为差异有统计学意义。柱形图采用 GraphPad Prism 5 软件制作。

李军丽,石亚男,占玲俊。活动性结核病铁过载小鼠模型建立及相关指标分析。中国比较医学杂志,已接受待出版