手足口病（hand, foot, and mouth disease, HFMD）是由肠道病毒引起的，以发热和手、足、口腔、臀部等部位出现皮疹、疱疹或疱疹性咽峡炎为主要特征的一种常见于小儿的急性传染病。手足口病多发生于入学前儿童，尤其是3岁以内的婴幼儿，少数患者会发展为重症，并发无菌性脑膜炎、脑干脑炎、神经源性肺水肿、急性弛缓性麻痹和心肌炎等，死亡率和致残率较高。人肠道病毒71型（EV71）是手足口病的主要病原体之一，属于微小RNA病毒科，肠道病毒属，主要通过粪口传播，引发婴幼儿手足口病及疱疹性咽峡炎，严重并发症包括无菌性脑膜炎，而神经源性的肺水肿或肺出血是导致婴幼儿死亡的原因之一。EV71病毒最初定植于鼻咽部或胃肠道粘膜，侵入淋巴组织并在其中繁殖，进而引起第一次病毒血症。若机体免疫力差，病毒可扩散至全身组织器官，大量繁殖后再次入血，引起第二次病毒血症，最终侵犯靶器官，如脑、脑膜、脊髓、心肌和横纹肌以及皮肤黏膜组织，引起重症病变，主要病变为神经元坏死等。

根据前期预实验结果确定攻毒量，建立重症EV71小鼠模型，9日龄BALB/c乳鼠轻度麻醉后，经腹腔注射104.5 TCID50临床分离株NX10-147 (GenBank登录号KJ004556，分离于2010年宁夏)，攻毒剂量为250 μl/只；空白对照组乳鼠(n=12)腹腔注射等量RD细胞上清，其中3只取其血清作为对照组血清。分别在3、6、12 hpi 和1、2、3、5、7、9 dpi采集每组各3只乳鼠血清以备检测血清中的细胞因子。在3 dpi和5 dpi每组各剖杀3只乳鼠，立即取其脑干、脊髓、肺脏、后肢骨骼肌和空肠固定在4 %多聚甲醛中，以备组织病理学检测；同时，每组另剖杀3只乳鼠取以上组织冻存，以备病毒RNA提取和组织内病毒载量测定。临床症状观察共持续14天。

手足口病（hand, foot, and mouth disease, HFMD）是由肠道病毒引起的，以发热和手、足、口腔、臀部等部位出现皮疹、疱疹或疱疹性咽峡炎为主要特征的一种常见于小儿的急性传染病。手足口病多发生于入学前儿童，尤其是3岁以内的婴幼儿，少数患者会发展为重症，并发无菌性脑膜炎、脑干脑炎、神经源性肺水肿、急性弛缓性麻痹和心肌炎等，死亡率和致残率较高。人肠道病毒71型（EV71）是手足口病的主要病原体之一，属于微小RNA病毒科，肠道病毒属，主要通过粪口传播，引发婴幼儿手足口病及疱疹性咽峡炎，严重并发症包括无菌性脑膜炎，而神经源性的肺水肿或肺出血是导致婴幼儿死亡的原因之一。EV71病毒最初定植于鼻咽部或胃肠道粘膜，侵入淋巴组织并在其中繁殖，进而引起第一次病毒血症。若机体免疫力差，病毒可扩散至全身组织器官，大量繁殖后再次入血，引起第二次病毒血症，最终侵犯靶器官，如脑、脑膜、脊髓、心肌和横纹肌以及皮肤黏膜组织，引起重症病变，主要病变为神经元坏死等。

（1）病毒准备：使用的小鼠适应株为MP10，为FY0805a在小鼠体内连续传代10次后的小鼠适应株，GenBank存储号为HQ712020。 （2）实验动物：使用SPF级别的7日龄ICR乳鼠，母鼠自然哺乳，在动物生物安全二级实验室内独立饲养。ICR小鼠毛色白化。适应性强，体格健壮，繁殖力强，生长速度快，实验重复性较好。是国际通用的封闭群小鼠。外周血项和骨髓细胞，具有较好的稳定性，是良好的血液学实验用动物。是进行手足口病原研究的理想动物。 （3）病毒感染：根据预实验确定感染剂量，7日龄乳鼠，经口灌胃感染107 TCID50 的EV71 MP10病毒,攻毒体积为100微升/只，空白对照组注射等量RD细胞上清。

手足口病（hand, foot, and mouth disease, HFMD）是由肠道病毒引起的，以发热和手、足、口腔、臀部等部位出现皮疹、疱疹或疱疹性咽峡炎为主要特征的一种常见于小儿的急性传染病。手足口病多发生于入学前儿童，尤其是3岁以内的婴幼儿，少数患者会发展为重症，并发无菌性脑膜炎、脑干脑炎、神经源性肺水肿、急性弛缓性麻痹和心肌炎等，死亡率和致残率较高。人肠道病毒71型（EV71）是手足口病的主要病原体之一，属于微小RNA病毒科，肠道病毒属，主要通过粪口传播，引发婴幼儿手足口病及疱疹性咽峡炎，严重并发症包括无菌性脑膜炎，而神经源性的肺水肿或肺出血是导致婴幼儿死亡的原因之一。EV71病毒最初定植于鼻咽部或胃肠道粘膜，侵入淋巴组织并在其中繁殖，进而引起第一次病毒血症。若机体免疫力差，病毒可扩散至全身组织器官，大量繁殖后再次入血，引起第二次病毒血症，最终侵犯靶器官，如脑、脑膜、脊髓、心肌和横纹肌以及皮肤黏膜组织，引起重症病变，主要病变为神经元坏死等。

（1）转基因小鼠构建：以人PSGL-1的mRNA为模板，经反转录获得人PSGL-1的cDNA，将其插入pCDNA3.1(+)载体的启动子下游，构建转基因载体。载体经测序验证正确后，将其线性化并经显微注射到C57BL/6J的受精卵中，用129做假孕受体，制备转基因小鼠。转基因小鼠提取鼠尾DNA进行基因鉴定（h-PSGL-F: 5’-CTACCAAAAGAGGTCTGTTC-3’；h-PSGL-R: 5’-ATGAGATGCAGACCATCTCG-3’），采用RT-PCR法检测组织内基因表达情况（h-PSGL-CF: 5’-GTGGTGCTGGCGGTCCG-3’；h-PSGL-CR: 5’-CAGGCCCCCATTGGCTGTG-3’），并用兔抗人PSGL-1的多克隆抗体检测组织内蛋白表达情况。 （2）病毒制备：使用的临床分离株包括：1.FY0805a，2008年分离自安徽省阜阳市，GenBank存储号为HQ882182；2.JK2009,2009年分离自重庆市，GenBank存储号为HQ694982；使用的小鼠适应株为MP10，为FY0805a在小鼠体内连续传代10次后的小鼠适应株，GenBank存储号为HQ712020。EV71在人横纹肌瘤细胞（RD）中培养、繁殖，采用三次冻融法释放病毒，超速离心法富集病毒，病毒储存于超低温冰箱中，病毒储存液浓度为1×109 TCID50/ml。 （3）实验动物：可使用SPF级别的10日龄乳鼠，品系为C57BL/6J-TgN(CMV-Homo-PSGL-1) -ZLFILAS，母鼠自然哺乳，在动物生物安全二级实验室内独立饲养。 （4）病毒感染：根据预实验确定感染剂量，10日龄乳鼠经轻度麻醉后，经腹腔注射1×108 TCID50 的EV71JK2009,攻毒体积为100微升/只；小鼠适应株EV71 MP10的感染剂量为5×106 TCID50，注射体积为100微升/只，空白对照组注射等量RD细胞上清。

Jiangning Liu, Wei Dong, Xiongzhi Quan, Chunmei Ma, Chuan Qin, Lianfeng Zhang. Transgenic expression of human P-selectin glycoprotein ligand-1 is not sufficient for enterovirus 71 infection in mice. Arch Virol (2012) 157: 539-543.

糖尿病；高脂血症

糖尿病

敲除外显子3-7

1Zhang CY; Baffy G; Perret P; Krauss S; Peroni O; Grujic D; Hagen T; Vidal-Puig AJ; Boss O; Kim YB; Zheng XX; Wheeler MB; Shulman GI; Chan CB; Lowell BB. 2001. Uncoupling protein-2 negatively regulates insulin secretion and is a major link between obesity, beta cell dysfunction, and type 2 diabetes. Cell 105(6):745-55. 2Andrews ZB; Erion DM; Beiler R; Choi CS; Shulman GI; Horvath TL. 2010. Uncoupling protein-2 decreases the lipogenic actions of ghrelin. Endocrinology 151(5):2078-86. 3Andrews ZB; Horvath B; Barnstable CJ; Elseworth J; Yang L; Beal MF; Roth RH; Matthews RT; Horvath TL. 2005. Uncoupling protein-2 is critical for nigral dopamine cell survival in a mouse model of Parkinson's disease. J Neurosci 25(1):184-91.

维生素E缺乏症

敲除外显子1和2

Terasawa Y; Ladha Z; Leonard SW; Morrow JD; Newland D; Sanan D; Packer L; Traber MG; Farese RV Jr. 2000. Increased atherosclerosis in hyperlipidemic mice deficient in alpha -tocopherol transfer protein and vitamin E Proc Natl Acad Sci U S A 97(25):13830-4PubMed: 11095717MGI: J:66419

癌症

敲除了外显子3-5

Tang T, Li L, Tang J, Li Y, Lin W, Martin F, Deanna Grant D, Solloway M, Parker L, Weilan Ye W, Forrest W, Ghilardi N, Oravecz T, Platt KA, Rice DS, Hansen GM, Abuin A, Eberhart DE, Godowski P, Holt KH, Peterson A, Zambrowicz BP, de Sauvage FJ. A mouse knockout library for secreted and transmembrane proteins. Nat Biotechnol. 2010 July; 28(7):749–755.

癌症

敲除外显子1和2

Tang T, Li L, Tang J, Li Y, Lin W, Martin F, Deanna Grant D, Solloway M, Parker L, Weilan Ye W, Forrest W, Ghilardi N, Oravecz T, Platt KA, Rice DS, Hansen GM, Abuin A, Eberhart DE, Godowski P, Holt KH, Peterson A, Zambrowicz BP, de Sauvage FJ. A mouse knockout library for secreted and transmembrane proteins. Nat Biotechnol. 2010 July; 28(7):749–755. (Medline PMID: 20562862)

脂肪酸代谢相关疾病

在外显子1和2的两端插入loxp位点

He W; Barak Y; Hevener A; Olson P; Liao D; Le J; Nelson M; Ong E; Olefsky JM; Evans RM. 2003. Adipose-specific peroxisome proliferator-activated receptor gamma knockout causes insulin resistance in fat and liver but not in muscle. Proc Natl Acad Sci U S A 100(26):15712-7PubMed: 14660788MGI: J:88210

代谢系统疾病相关

敲除外显子12

Kusinski LC; Stanley JL; Dilworth MR; Hirt CJ; Andersson IJ; Renshall LJ; Baker BC; Baker PN; Sibley CP; Wareing M; Glazier JD. 2012. eNOS knockout mouse as a model of fetal growth restriction with an impaired uterine artery function and placental transport phenotype. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 303(1):R86-93PubMed: 22552791MGI: J:190504

代谢系统疾病相关

外显子两端插入loxp位点

代谢系统相关疾病

neo基因插入破坏2号外显子

Ladenheim EE; Hamilton NL; Behles RR; Bi S; Hampton LL; Battey JF; Moran TH. 2008. Factors contributing to obesity in bombesin receptor subtype-3-deficient mice. Endocrinology 149(3):971-8PubMed: 18039774MGI: J:134021