阿尔茨海默病（AD）是一种起病隐匿的进行性发展的神经系统退行性疾病。临床上以记忆障碍、失语、失用、失认、视空间技能损害、执行功能障碍以及人格和行为改变等全面性痴呆表现为特征，病因迄今未明。65岁以前发病者，称早老性痴呆；65岁以后发病者称老年性痴呆。小胶质细胞(microglia)系神经组织中唯一来源于中胚层的细胞。此细胞体很小，呈短棒状，伸出数支枯条样突起，突起表面粗糙，显有棘刺，分支少。胞核较小，约为5μm，形态不规则，可呈肾形、椭圆形或三角形，核染色质多。此细胞在中枢神经系统内分布较少。在灰质内多位于神经元胞体附近或在小血管周围，在白质内也可见到。小胶质细胞具有多突触及可塑性的特点，为中枢神经系统内固有的免疫效应细胞，在中枢神经系统的生理过程中发挥着极其重要的作用。首先，小胶质细胞对于神经系统的正常发育是必需的。在大脑发育的早期阶段，约20%～80%具有长投射轴突的神经元发生凋亡并迅速被清除，激素、神经递质或分泌的蛋白质等细胞外信号可与神经元上的特异性受体结合，促进神经元的存活或启动神经元发生程序性细胞死亡，从而对中枢神经系统内神经元的数量进行调控。 小胶质细胞参与一系列神经退行性疾病的发生，小胶质细胞活化和神经炎症为神经病理学的主要特征。它介导中枢神经系统损伤和疾病的内源性免疫反应，从而发挥神经保护或神经毒性作用。任何神经系统紊乱，通常可导致炎症和小胶质细胞的激活，同时胶质细胞的数量增加，表型发生改变，这种现象被称为“反应性胶质增生”。在急性神经退行性疾病（中风、脑缺氧、脑外伤）中，小胶质细胞表型发生改变并释放炎症介质，释放的炎症介质主要为细胞因子和趋化因子。这些急性炎症反应对神经细胞的存活通常是有益的，可使脑内的继发性损伤减轻，使受损的组织得到修复。小胶质细胞介导的慢性炎症参与多种慢性神经变性性疾病的病理过程，包括：阿尔茨海默症、帕金森病、亨廷顿舞蹈症、肌萎缩侧索硬化症等。慢性炎症过程中，小胶质细胞被长时程激活，随后持续释放一系列炎症介质，导致氧化应激反应。通常认为，小胶质细胞介导的慢性炎症反应对机体是有害的，可造成神经组织损伤。

利用CRISPR/cas9介导的大鼠基因敲入技术，在Tmem119基因启动子下游插入P2A串联的mCherry-CRE表达框构建Tmem119驱动的表达CRE的大鼠模型。

肥厚型心肌病（Hypertrophic cardiomyopathy, HCM），肥厚型心肌病是原发性心肌病主要类型之一，以心肌肥厚、心肌纤维排列紊乱为特征，临床表现包括呼吸困难，心绞痛，晕厥及猝死。HCM是常染色体显性遗传性疾病，60%~70%为家族性，目前，已证实至少14个基因突变与肥厚型心肌病的发病有关，其中有10种为编码肌小节结构蛋白的基因，绝大部分突变位于这些基因中。

利用CRISPR/cas9介导的大鼠基因敲入技术，将大鼠Myh7基因c.1357C>T突变敲入到原Myh7基因中替换野生型，建立基因突变大鼠。

肥厚型心肌病(hypertrophic cardiomyopathy，HCM)是一种主要由心肌肌小节基因突变导致的常染色体显性遗传病，以无明显诱因下出现的以非对称性室间隔肥厚(≥13mm)为主的左室肥厚为主要表现，大多数患者无症状，预后良好，少数患者可同时出现黑朦，晕厥，心绞痛，心力衰竭及心源性猝死(sudden cardiac death，SCD)，是青年人SCD的首要原因。心肌肌球蛋白结合蛋白-C(MyBP-C)位于心肌肌小节中的C区(A带中包含有横桥的区域)，约占肌原纤维中蛋白总数的2%。该蛋白属于免疫球蛋白超家族，由1273个氨基酸残基构成，分子量149 kDa。其编码基因MYBPC3位于染色体11p11。2，是人类发现的第二个HCM致病基因。该基因突变类型以无义突变和移码突变为主，携带者约占所有HCM患者的30~40%，在部分地区是HCM的首要致病基因。尽管部分错义突变能够降低MyBP-C与肌球蛋白结合的能力，但多数错义突变既不影响MyBP-C的功能，也不影响其稳定性。总体来说，绝大多数MYBPC3突变属于低危突变，外显率较低。其携带者往往发病较晚(30岁以前外显率较低)，心肌肥厚程度较低，症状较轻，猝死率低，预后较好。但亦有部分类型的突变，如移码突变IVS20-2A>G和IVS7+1G>A，其携带者发病较早，表现为严重的心肌肥厚，呼吸困难，胸痛，症状性心动过速，反复发作的晕厥甚至猝死。c。2067+1G-->A突变与重度心肌肥厚及中度的SCD发生风险相关。

利用CRISPR/cas9介导的大鼠基因敲入技术，将大鼠MYBPC3基因c.3293G>A突变敲入到原MYBPC3基因中替换野生型，建立MYBPC3W1098*基因突变大鼠。

Pde4d基因编码多个涉及环磷酸腺苷(cAMP)信号切割的亚型，编码的蛋白属于磷酸二酯酶家族，参与cAMP的水解，但不影响cGMP。在多种细胞类型中充当信号转导分子。该基因使用不同的启动子产生多个可选剪接的转录变异，编码功能蛋白。PDE4D已被发现在多种人类癌症中促进肿瘤的发展，包括肺癌、前列腺癌、黑色素瘤和胃癌等。PDE4D在心肌梗死的心肌细胞中发生过表达，而高表达的PDE4D可以促进心肌细胞凋亡。PDE4D也被发现可通过调节细胞凋亡增加缺血性卒中(IS)的发生风险，是导致脑I/R损伤的关键因素之一。

基因敲除构建设计。

Hbxip基因（Lamtor5）首次在人肝癌细胞系HepG2中发现，编码一种与乙型肝炎病毒X蛋白(HBx) C端特异性结合的蛋白。该蛋白的功能是负向调节HBx的活性，从而改变病毒的复制生命周期。HBXIP蛋白与多种致癌信号相关：HBXIP通过NF-kB信号通路促进细胞增殖；通过氨基酸激活mTORC1信号通路，促进癌细胞增殖和迁移；通过pAKT/MDM2途径促进人乳腺癌生长。多项研究表明，HBXIP与多种恶性肿瘤的发生发展密切相关，包括乳腺癌、肝癌、肺癌等，可能作为癌蛋白参与多种肿瘤细胞的增殖、凋亡和迁移。此外，HBXIP在调节糖代谢中也具有重要作用，参与了对胰岛素基因的转录调控。

基因敲除构建设计

低磷性佝偻病（Hypophosphatemicriskers）是儿童常见的代谢性骨病，是由于各种原因引起肾小管对磷的重吸收障碍，从而导致骨发育不良的一组肾失磷性代谢性骨病，临床表现为低磷血症、身材矮小、双下肢骨骼畸形。儿童期的低磷性佝偻病多为遗传性，包括常染色体显性遗传（ADHR）、常染色体隐性遗传（ARHR）、X连锁遗传（XLHR）、伴高钙尿症的遗传性低磷性佝偻病（HHRH）等。Enpp1基因是已确定的可导致低磷性佝偻病的基因之一，属于常染色体隐性遗传。婴儿全身动脉钙化(Generalized Arterial Calcification of Infancy，GACI)是少见的疾病，其特点是伴不规则内膜增厚的弥漫性动脉钙化，冠状动脉受累，通常在9个月前死亡。Enpp1基因也被证实与GACI有关。它编码的蛋白是一种II型跨膜糖蛋白，属于核苷焦磷酸酶/磷酸二酯酶家族，最早发现于浆细胞（PC）中；在许多非淋巴组织中表达，包括软骨、心脏、肾脏、肝脏和唾液腺，并在软骨细胞、成骨细胞和血管平滑肌细胞中高表达；参与多种生物学途径。首先，ENPP1蛋白具有广泛的底物特异性，包括ATP、UTP、cAMP和2'3'-cGAMP。该酶催化5' -磷酸二酯酶键，主要在ATP中，生成核苷5'-单磷酸和无机焦磷酸盐(PPi)，后者是骨形成过程中矿物结晶的抑制剂。对于Enpp1基因进行失活突变或基因沉默的小鼠，由于关节和椎旁韧带过度钙化，表现出“关节僵硬”和“踮脚走路”的表型。Enpp1突变也会导致小鼠和人类的血管钙化，导致人类常染色体隐性低磷血症性佝偻病(ARHR)或婴儿期广义动脉钙化(GACI)。其次，ENPP1通过将ATP分解为AMP来介导核苷酸循环，而AMP再被5'核苷酸酶转化为腺苷，腺苷则被自由地运输到细胞中进行新陈代谢。ATP和腺苷都具有免疫调节功能。第三，ENPP1参与脂肪细胞分化，并在碳水化合物代谢和胰岛素抵抗中发挥作用；ENPP1与胰岛素受体结合，抑制下游信号通路，从而诱导胰岛素抵抗和葡萄糖耐受。第四，ENPP1对于正常B细胞的发育是必不可少的，而且对于长寿浆细胞（LLPC）的发育和生存更是至关重要。Enpp1突变模型也应用于衰老研究。

基因敲除构建设计

Ddit4也称为Redd1，编码的蛋白参与调控发育以及DNA损伤反应，是一种保守的应激反应基因；在缺氧、糖皮质激素、DNA损伤等多种细胞应激作用下表达量显著增加。DDIT4参与多种病理过程，包括氧诱导视网膜病变、肺气肿、帕金森病、抑郁症、糖尿病和癌症。许多疾病都与骨骼肌功能损害有关，即肌肉质量下降和疲劳能力增加。DDIT4可通过调节细胞生存和增殖整合上游反应，消减因刺激造成的组织损伤，DDIT4也与ROS的产生有关。另一方面，DDIT4通过调节促凋亡和抗凋亡基因的表达，提高细胞活力和生长速度。还有研究表明DDIT4参与脂多糖诱导的炎症反应。

基因敲除构建设计。

Usp18编码的蛋白属于泛素特异性蛋白酶(UBP)家族，在肝脏和胸腺高表达，并定位于细胞核。USP18蛋白是泛素样蛋白ISG15特异性蛋白酶，可有效的切割ISG15的融合，并从特定底物中移除多泛素链。Usp18也是一种干扰素刺激基因，参与IFN-I信号的负调控。研究表明在Usp18敲除小鼠中，由于Usp18的缺失，I型IFN反应过度激活，可以导致小鼠骨质减少的表型。而在细菌感染模型中，例如单核增生李斯特菌或金黄色葡萄球菌感染小鼠，USP18蛋白可以通过抑制TNF-α来促进细菌的复制；而抑制USP18功能可以通过增强TNF-α的抗菌作用来促进对原发性和继发细菌感染的控制，从而使USP18成为细菌感染治疗的靶点之一。此外发现USP18通过调节TAK1依赖的p38和JNK1/2信号通路，发挥了抑制病理性心脏重构的作用。USP18蛋白还具有抗病毒活性，以及对癌症的抑制作用。

采用Cas9进行基因敲除。

慢性结直肠炎的主要症状有：①排便异常：多数患者有便秘、腹泻或便秘腹泻交替出现。②血便、粘液便或脓血粘液便：多数患者有粘液或粘液血便，直肠炎症明显时可有血便或脓血便。③腹痛：可有轻至中度下腹隐痛，有腹痛—便意—便后缓解的规律。④肛内感觉异常：直肠炎患者常有大便不尽，里急后重感，亦可伴有肛内灼热、疼痛等感觉异常。结肠直肠癌（carcinoma of colon and rectum）是胃肠道中常见的恶性肿瘤，早期症状不明显，随着癌肿的增大而表现排便习惯改变、便血、腹泻、腹泻与便秘交替、局部腹痛等症状，晚期则表现贫血、体重减轻等全身症状。Muc2基因编码的蛋白属于粘蛋白家族的一员，粘蛋白是许多上皮组织产生的高分子量糖蛋白。大部分肠道黏液蛋白由Muc2基因编码并由杯状细胞分泌，这种不可溶解的粘液屏障可以保护肠腔。Muc2基因的遗传缺陷可导致粘液减少90%，肠上皮细胞暴露于肠腔内容物增加，同时小鼠肠道内细胞增殖、迁移和凋亡发生改变，最终导致自发性结肠炎和结直肠癌，进一步研究表明：Muc2缺陷小鼠自发发展为慢性结肠炎在早期年龄(<3个月)，其组织病理学是类似于溃疡性结肠炎的病人；3个月后，Muc2−/−小鼠更容易发生结肠或直肠肿瘤。因此，Muc2基因敲除小鼠是研究慢性结肠炎和结肠癌的理想模型。同时，由于肠道生态失调与结肠炎相关的结直肠癌发生有关，Muc2基因敲除小鼠也是研究肠道微生物对肠道保护作用的优选模型。

基因敲除构建设计

Mbd4基因编码的蛋白质是一种多结构域蛋白，包括一个C端单功能胸腺嘧啶-尿嘧啶DNA糖基化酶和一个N端甲基- cpg结合域（MBD），其甲基- cpg结合域将酶定位于基因组的富含cpg的区域，启动碱基切除修复(BER)，修正由于5-甲基胞嘧啶(5MeC)或胞嘧啶脱氨产生的T:G或U:G错配。研究表明，MBD4介导的DNA修复可能对慢性炎症组织的致癌作用非常重要。在人类中，MBD4的序列和表达的改变与癌症风险的升高有关。MBD4 Glu346Lys多态性与结肠直肠癌、食管鳞状细胞癌和肺腺癌的风险增加相关。在一些自身免疫性疾病中也观察到MBD4的多态性或表达改变，这表明MBD4与反常的免疫反应之间可能存在联系。在小鼠实验表明Mbd4可以抑制溃疡性结直肠炎症相关的结肠癌小鼠模型的发病率和死亡率：Mbd4−/−小鼠比野生型小鼠的生存时间更短，死亡时的肿瘤负荷更大，临床症状更严重。组织病理学检查也发现Mbd4−/−小鼠的炎症和组织损伤更严重。

基因敲除构建设计

肥胖是指身体超重，脂肪异常堆积的状态。肥胖与多种疾病有关，如糖尿病、某些癌症、高血压和心血管疾病。肥胖一直被认为是由个人习惯造成的，主要是热量摄入过多和缺乏锻炼。此外，遗传成分，如遗传缺陷和遗传变异，包括瘦素基因突变，也可能对超重和肥胖的发展有强大的作用等。瘦蛋白是一种由白色脂肪细胞、骨骼肌、胎盘和垂体等组织产生的激素，主要由脂肪组织分泌；影响下丘脑，调节食欲和能量平衡，从而导致体重增加。同时，瘦蛋白对于维持垂体GH细胞及其功能也很重要。当促生长激素细胞的瘦蛋白受体发生缺失，则导致GH细胞数量减少、循环生长激素减少，最终引起成体性肥胖。Lep基因缺失导致小鼠自发性肥胖，基因敲除的纯合子小鼠具有肥胖、嗜食、活性低、代谢效率高、产热受损、不孕和寿命短等表型，体重达到正常小鼠的三倍，影响糖尿病的严重程度和病程。与高脂饮食诱导的肥胖(DIO)小鼠相比，Lep基因敲除小鼠表现出不受调节的进食(贪食)，这导致肥胖、糖尿病和比DIO小鼠症状更为严重的疾病。

1.根据Lep 的基因组序列结构，设计CRISPR 靶点： 根据目前基因组数据，Lep 基因存在2 个转录产物，见下图： http://asia.ensembl.org/Mus_musculus/Gene/Summary?db=core;g=ENSMUSG00000059201;r=6:29060220-29073877 Lep 保守区域分析： 根据Lep 基因组结构和蛋白功能保守区，Lep 有2 个转录产物。选取Lep-201进行设计，Exon2-3(aa1-167)，为编码蛋白的转录产物的外显子,而且也是Lep 基因所有转录本Lep-202 的全部的外显子序列，删除这Exon2-3 后，翻译该蛋白的mRNA 将不会被转录出来，而且该基因被完全敲除。因此决定在Exon2-3 的两边设计靶点，实现Exon2-3 敲除。 下面将根据Exon8 设计条件性敲除方案。 转录产物Lep-201 的基因组结构： 2.F0 代构建及繁殖： 基因敲除构建设计。

心血管疾病（Cardiovascular diseases，CVD）是人类死亡的主要原因之一，血清中脂蛋白水平是心血管疾病发展最重要的危险因素/预测因素之一。其中高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C) 和甘油三酯(TG)水平是重要指标。HDL-C是参与胆固醇逆向转运和胆固醇酯在脂蛋白之间转移的关键成分，其水平与冠心病风险呈负相关，并被解释为预测CVD风险的关键指标。而TG水平升高也被认为是CVD发展的独立风险标志。CETP基因编码的蛋白质存在于血浆中，在脂蛋白代谢中起着重要作用，促进胆固醇酯从HDL-C向低密度脂蛋白(LDL)以及富含三甘油三酯的极低密度脂蛋白(VLDL)的净转运，以及TG从VLDL到高密度脂蛋白的等摩尔转运。该基因的缺陷是导致高脂蛋白血症(HALP1)的原因之一。CETP与静脉血栓形成(VT)风险之间也存在关联性，和血浆凝固性之间也有关联。CETP不同转录变异型与高HDL-C水平和低冠状动脉疾病风险具有相关性。

1.全身性过表达转基因载体： 通过将构建好的表达元件插入进PiggyBac 转座子系统的两个ITR 元件之间，然后将构建好的转基因载体和转座酶cRNA 共注射进小鼠的受精卵中，即可获得高阳性率及高表达率转基因小鼠。 插入基因为人源CETP基因，Gene ID：1071，位于：Chromosome 16: 56,961,850-56,983,845 forward strand。 2.CETP 转基因小鼠构建：