基因敲除纯合子表现出体液免疫缺陷，以及对胸腺依赖性抗原免疫的次生抗原特异性反应异常。小鼠的表型类似于人X连锁的高IgM综合征。

利用PGKneo盒替换X染色体上CD40配体基因（Cd40lg）的外显子3和4，从而实现CD40lg基因敲除。 将构建载体电穿孔到129S2 / SvPas衍生的D3胚胎干（ES）细胞中。 再将正确靶向的ES细胞注射到C57BL / 6胚泡中。

Renshaw BR; Fanslow WC 3rd; Armitage RJ; Campbell KA; Liggitt D; Wright B; Davison BL; Maliszewski CR. 1994. Humoral immune responses in CD40 ligand-deficient mice. J Exp Med 180(5):1889-900 Lazarevic V; Myers AJ; Scanga CA; Flynn JL. 2003. CD40, but not CD40L, is required for the optimal priming of T cells and control of aerosol M. tuberculosis infection. Immunity 19(6):823-35

Icosl基因敲除小鼠纯合子表现出T细胞依赖性B细胞免疫反应严重受损，缺陷的B细胞同种型转换为IgG1和IgE，以及T细胞产生的IL-4和IL-10受损。

使用含有新霉素抗性和单纯疱疹病毒胸苷激酶基因的靶向载体破坏编码该基因的大部分外显子2以及所有外显子3和4的2.8kb序列。 将构建体电穿孔到129P2 / OlaHsd衍生的E14胚胎干（ES）细胞中。 将正确靶向的ES细胞注射到C57BL / 6胚泡中。

Tafuri A; Shahinian A; Bladt F; Yoshinaga SK; Jordana M; Wakeham A; Boucher LM; Bouchard D; Chan VS; Duncan G; Odermatt B; Ho A; Itie A; Horan T; Whoriskey JS; Pawson T; Penninger JM; Ohashi PS; Mak TW. 2001. ICOS is essential for effective T-helper-cell responses. Nature 409(6816):105-9

肌萎缩侧索硬化（ALS）也叫运动神经元病（MND），是一种累进性神经退行疾病，以控制肌肉收缩的上、下运动神经元选择性退化和凋亡为特征，引发瘫痪、最终导致死亡，患病率约为4-6/10万。大约10%的ALS病例是家族型的，90%是散发型的。从发现SOD1基因突变到现在，共确定了30余种致病基因，其中C9orf72，FUS，TARDBP，SOD1等比例较高，而EPHA4，ATXN2等20余种基因比率较低。肌萎缩侧索硬化症病因涉及兴奋毒性、氧化应激、神经营养因子、自身免疫、中毒、感染等，目前无有效的治疗方法，仍然是 “不治之症”。 已发现的30种致病基因和修饰基因与ALS的病理发生有关，其机制可归纳为细胞表面受体、RNA加工、蛋白质合成、能量代谢、内质网功能、轴突转运等几个方面的异常。其中C9orf72和EPHA4分别参与了RNA加工、内质网、细胞膜受体三种ALS的发病机制。 C9orf72蛋白与细胞运输和自噬有关，敲低斑马鱼的C9orf72表达可干扰神经分支的形成和缩短运动神经元轴突，推测C9orf72表达水平降低影响了神经元内细胞运输。

基于CRISPR/Cas9技术建立C9orf72基因敲除大鼠，具体设计策略见图1A。

1. Dong, W., Ma, Y., Guan, F., Zhang, X., Chen, W., Zhang, L. * and Zhang, L. * (2021), Ablation of C9orf72 together with excitotoxicity induces ALS in rats. FEBS J., 288: 1712-1723. 2. 张丽, 张连峰*。肌萎缩侧索硬化症相关基因突变与疾病动物模型[J]. 中国比较医学杂志, 2017, 027(010):89-95.

阿尔茨海默病(Alzheimer disease , AD) 是一种常见的中枢神经系统进行性的退行性疾病，临床表现为进行性记忆减退和认知障碍，我国65岁以上老人痴呆症的发病率为5.56%。 CYP2E1基因编码一个细胞色素P450超家族的酶。细胞色素P450蛋白是一种单加氧酶，对药物代谢和胆固醇、甾体和其他脂类的合成进行催化。CYP2E1蛋白定位于内质网，由乙醇、糖尿病状态和饥饿诱导。该酶既代谢内源性底物，如乙醇、丙酮和缩醛，也代谢外源性底物，包括苯、四氯化碳、乙二醇和亚硝胺。CYP2E1酶的底物多样，因此可能参与糖异生、肝硬化、糖尿病和癌症等多种过程。氧化应激、能量代谢是AD的发病机制之一，因此CYP2E1可能对于AD的病理发展具有调节作用。

PDGF启动子下游插入CYP2E1的cDNA构建脑特异过表达载体，显微注射获得转基因大鼠（见图1）。 图1 PDGF-CYP2E1转基因载体设计策略

心肌病是一组异质性心肌疾病，由不同病因引起心脏机械和电活动的异常，表现为心室不适当的肥厚或扩张。严重心肌病会引起心血管性死亡或进展性心力衰竭。心肌病通常分为原发性心肌病和继发性心肌病，其中原发性心肌病包括扩张型心肌病、肥厚型心肌病、限制型心肌病、致心律失常性右室心肌病和未定型心肌病。继发性心肌病指心肌病是全身性疾病的一部分。

将a-synuclein 的cDNA插入α-MHC启动子下游，构建心肌过表达载体（见图1），显微注射获得转基因首建鼠，首建鼠与野生SD大鼠杂交传代后进行表达鉴定。 图1 α-MHC-a-synuclein过表达质粒构建

心肌病是一组异质性心肌疾病，由不同病因引起心脏机械和电活动的异常，表现为心室不适当的肥厚或扩张。严重心肌病会引起心血管性死亡或进展性心力衰竭。心肌病通常分为原发性心肌病和继发性心肌病，其中原发性心肌病包括扩张型心肌病、肥厚型心肌病、限制型心肌病、致心律失常性右室心肌病和未定型心肌病。继发性心肌病指心肌病是全身性疾病的一部分。

将a-synuclein-A53T的cDNA插入α-MHC启动子下游，构建心肌过表达载体（见图1），显微注射获得转基因首建鼠，首建鼠与野生SD大鼠杂交传代后进行表达鉴定。 图1 α-MHC-a-synuclein-A53T过表达质粒构建

神经系统通用工具鼠，与tetO启动子转基因鼠杂交可以实现特定靶基因在星形胶质细胞诱导表达，不与某一种疾病类型直接相关。

将四环素反应性转录激活因子（tTA）插入人胶质纤维酸性蛋白GFAP启动子下游，注射载体到小鼠受精卵中，建立在星形胶质细胞中表达tTA的转基因小鼠。

Wang J; Lin W; Popko B; Campbell IL. 2004. Inducible production of interferon-gamma in the developing brain causes cerebellar dysplasia with activation of the Sonic hedgehog pathway. Mol Cell Neurosci 27(4):489-96

帕金森病是以运动和非运动症状为特征的中老年神经系统退行性疾病，其主要症状表现为运动迟缓、静止性震颤、肌肉僵直及姿势平衡障碍等，严重影响患者生活质量。有公开数据显示，中国65岁以上的老年人帕金森患病率为1.7%，据此推算，中国的帕金森病人数量或超300万。α-突触核蛋白是突触核蛋白家族的一员，α-突触核蛋白可以整合突触前信号和膜转运。α-突触核蛋白的基因缺陷与帕金森病的发病机制有关。

将编码人SNCA A53T突变基因插入tetO启动子下游构建载体，显微注射获得携带SNCAA53T突变的转基因小鼠。

Lin X; Parisiadou L; Gu XL; Wang L; Shim H; Sun L; Xie C; Long CX; Yang WJ; Ding J; Chen ZZ; Gallant PE; Tao-Cheng JH; Rudow G; Troncoso JC; Liu Z; Li Z; Cai H. 2009. Leucine-rich repeat kinase 2 regulates the progression of neuropathology induced by Parkinson's-disease-related mutant alpha-synuclein. Neuron 64(6):807-27PubMed: 20064389MGI: J:156512

神经管畸形，又称神经管缺陷，是一种严重的畸形疾病，神经管就是胎儿的中枢神经系统。在胚胎的第15～17日开始，神经系统开始发育，至胚胎22日左右，神经褶的两侧开始互相靠拢，形成1个管道，称为神经管，它的前端称为神经管前孔，尾端称为神经管后孔，胚胎在24、25日及26日时，前孔及后相继关闭。胎儿神经管畸形主要表现为无脑儿、脑膨出、脑脊髓膜膨出、脊柱裂/隐性脊柱裂、唇裂及腭裂等。

胚胎干细胞打靶获得Plexin-B2基因敲除小鼠。

[1] Friedel R H , Kerjan G , Rayburn H , et al. Plexin-B2 Controls the Development of Cerebellar Granule Cells[J]. Journal of Neuroscience the Official Journal of the Society for Neuroscience, 2007, 27(14):3921-32.

孤独症（autism），又称自闭症或孤独性障碍（autistic disorder）等，该症一般起病于3岁以内，主要表现为三大类核心症状，即：社会交往障碍、交流障碍、兴趣狭窄和刻板重复的行为方式。

用一个靶向载体将新霉素抗性盒替代内源性基因的从甲硫氨酸起始到跨膜VI区上游的编码区。将正确靶向的ES细胞注入囊胚。将得到的嵌合小鼠与C57BL/6小鼠杂交。

Wersinger S, Ginns E, O’Carroll AM, Lolait SJ, Young WS. Vasopressin V1b receptor knockout reduces aggressive behavior in male mice. Mol Psychiatry. 2002;7:975–984.

Bardet- Biedl综合征 (Bardet- Biedl syndrome, BBS)是常染色体隐性遗传性疾病 ,主要临床表现有视网膜营养不良、先天性肥胖、多指趾畸形、生殖腺发育不全、智力发育迟缓和肾畸形等。约 35 %的患者伴有耳聋 (主要为传导性耳聋 )。

胚胎干细胞打靶

[1] Gong Y, Yue J , Wu X , et al. NSPc1 is a cell growth regulator that acts as a transcriptional repressor of p21Waf1/Cip1 via the RARE element[J]. Nucleic Acids Research, 2006, 34(21):6158-6169.

Cdk5对中枢神经系统的正常发育至关重要，并参与成年神经系统的突触传递、突触可塑性和神经元信号传导等功能。该基因的突变与致死性常染色体隐性遗传的无头畸形有关。

在外显子1-5两侧插入loxP位点，建立Cdk5-loxP小鼠。Cdk5-loxP小鼠可与cre工具小鼠杂交，可以导致表达cre重组酶的组织特异性缺失Cdk5蛋白的表达。

Samuels BA; Hsueh YP; Shu T; Liang H; Tseng HC; Hong CJ; Su SC; Volker J; Neve RL; Yue DT; Tsai LH. 2007. Cdk5 promotes synaptogenesis by regulating the subcellular distribution of the MAGUK family member CASK. Neuron 56(5):823-37