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标识符 CSTR:16397.09.0C01000186
资源中文名称 EV71 MP10 腹腔感染PSGL1-C57BL/6J小鼠模型
资源英文名称 EV71 MP10 intraperitoneally infected PSGL1 C57BL/6J mouse model
疾病概述 手足口病(hand, foot, and mouth disease, HFMD)是由肠道病毒引起的,以发热和手、足、口腔、臀部等部位出现皮疹、疱疹或疱疹性咽峡炎为主要特征的一种常见于小儿的急性传染病。手足口病多发生于入学前儿童,尤其是3岁以内的婴幼儿,少数患者会发展为重症,并发无菌性脑膜炎、脑干脑炎、神经源性肺水肿、急性弛缓性麻痹和心肌炎等,死亡率和致残率较高。人肠道病毒71型(EV71)是手足口病的主要病原体之一,属于微小RNA病毒科,肠道病毒属,主要通过粪口传播,引发婴幼儿手足口病及疱疹性咽峡炎,严重并发症包括无菌性脑膜炎,而神经源性的肺水肿或肺出血是导致婴幼儿死亡的原因之一。EV71病毒最初定植于鼻咽部或胃肠道粘膜,侵入淋巴组织并在其中繁殖,进而引起第一次病毒血症。若机体免疫力差,病毒可扩散至全身组织器官,大量繁殖后再次入血,引起第二次病毒血症,最终侵犯靶器官,如脑、脑膜、脊髓、心肌和横纹肌以及皮肤黏膜组织,引起重症病变,主要病变为神经元坏死等。
实验动物背景信息

C57BL/6J小鼠

模型制作方法

(1)转基因小鼠构建:以人PSGL-1的mRNA为模板,经反转录获得人PSGL-1的cDNA,将其插入pCDNA3.1(+)载体的启动子下游,构建转基因载体。载体经测序验证正确后,将其线性化并经显微注射到C57BL/6J的受精卵中,用129做假孕受体,制备转基因小鼠。转基因小鼠提取鼠尾DNA进行基因鉴定(h-PSGL-F: 5’-CTACCAAAAGAGGTCTGTTC-3’;h-PSGL-R: 5’-ATGAGATGCAGACCATCTCG-3’),采用RT-PCR法检测组织内基因表达情况(h-PSGL-CF: 5’-GTGGTGCTGGCGGTCCG-3’;h-PSGL-CR: 5’-CAGGCCCCCATTGGCTGTG-3’),并用兔抗人PSGL-1的多克隆抗体检测组织内蛋白表达情况。

(2)病毒制备:使用的临床分离株包括:1.FY0805a,2008年分离自安徽省阜阳市,GenBank存储号为HQ882182;2.JK2009,2009年分离自重庆市,GenBank存储号为HQ694982;使用的小鼠适应株为MP10,为FY0805a在小鼠体内连续传代10次后的小鼠适应株,GenBank存储号为HQ712020。EV71在人横纹肌瘤细胞(RD)中培养、繁殖,采用三次冻融法释放病毒,超速离心法富集病毒,病毒储存于超低温冰箱中,病毒储存液浓度为1×109 TCID50/ml。

(3)实验动物:可使用SPF级别的10日龄乳鼠,品系为C57BL/6J-TgN(CMV-Homo-PSGL-1) -ZLFILAS,母鼠自然哺乳,在动物生物安全二级实验室内独立饲养。

(4)病毒感染:根据预实验确定感染剂量,10日龄乳鼠经轻度麻醉后,经腹腔注射1×108 TCID50 的EV71JK2009,攻毒体积为100微升/只;小鼠适应株EV71 MP10的感染剂量为5×106 TCID50,注射体积为100微升/只,空白对照组注射等量RD细胞上清。

模型表型数据

1)转基因小鼠鉴定:

PSGl-1转基因小鼠经RT-PCR和Western blotting鉴定,表明人PSGL-1蛋白主要在小鼠的骨骼肌和脑中表达,可检测到该基因的mRNA表达及蛋白(图1)。

2)动物症状:


EV71 MP10感染转基因小鼠后,动物自感染后第3天开始出现症状,表现为体重增长变缓、弓背竖毛、后肢行动迟缓至瘫痪、死亡等症状。感染后第4天时,动物全部表现出后肢瘫痪、停止进食等症状,感染后第5天动物开始出现死亡,在10天内全部死亡,该特征类似于EV71重症感染小鼠模型。实时荧光定量PCR检测表明病毒主要复制部位为骨骼肌和脑,病毒在感染后第3天达到高峰,主要病理表现为坏死性肌炎。

1. 人PSGL-1转基因小鼠鉴定.A,人PSGL-1基因设计;B,转基因小鼠基因型鉴定;C,骨骼肌和脑内人PSGL-1基因的mRNA检测;D,Western blotting检测骨骼肌和脑内人PSGL-1蛋白表达检测。

3)转基因小鼠与野生小鼠模型的区别


制作人PSGL-1转基因小鼠的主要目的,是验证表达人PSGL-1蛋白能否提高小鼠对EV71的敏感性,因此,可通过EV71的临床分离株和小鼠适应株来分别测验人PSGL-1对EV71感染的促进效果。

2. EV71临床分离株JK2009感染人PSGL-1转基因小鼠和野生型小鼠后,病毒在骨骼肌中的复制曲线。● 野生型小鼠;○ 转基因小鼠。

   EV71的临床分离株JK2009感染小鼠后,分别在第1天、3天和5天分离骨骼肌,检测病毒载量,发现与野生型小鼠相比,转基因小鼠骨骼肌内的病毒载量并没有显著提高(图2)。

EV71的小鼠适应株MP10感染小鼠后,在第3天时,转基因小鼠的骨骼肌、脊髓和脑内的病毒载量显著高于野生型小鼠(图3A-C),但是在第5天时,该差别不再明显,表明表达人PSGL-1蛋白可以一过性的促进EV71小鼠适应株感染小鼠。与病毒复制相一致,第3天转基因小鼠的后肢出现双侧瘫痪,症状明显比野生型小鼠严重,但在第5天时症状类似(图3D-E)。提高病毒的感染剂量,并不能使两周以上的转基因小鼠表现出明显的症状,表明人PSGL-1具有一定的促进EV71感染效果。

3. EV71的小鼠适应株MP10感染转基因小鼠和野生型小鼠. A-C,组织内病毒载量,A(骨骼肌),B(脊髓),C(脑);D,临床症状评分的变化曲线;E,感染第3天和第5天时的小鼠状态照片。

动物模型的评价与验证 研究表明PSGL-1蛋白是人的EV71病毒受体之一,在小鼠细胞内表达人PSGL-1蛋白可以提高小鼠细胞对EV71的敏感性。 该模型的这些病理表型类似EV71感染重症病例,可用于EV71重症研究,以及药物筛选和疫苗评价。
保存方式 活体
合作方式 不限定
相关文章 Jiangning Liu, Wei Dong, Xiongzhi Quan, Chunmei Ma, Chuan Qin, Lianfeng Zhang. Transgenic expression of human P-selectin glycoprotein ligand-1 is not sufficient for enterovirus 71 infection in mice. Arch Virol (2012) 157: 539-543.
备注