C57BL/6J小鼠

（1）转基因小鼠构建：以人PSGL-1的mRNA为模板，经反转录获得人PSGL-1的cDNA，将其插入pCDNA3.1(+)载体的启动子下游，构建转基因载体。载体经测序验证正确后，将其线性化并经显微注射到C57BL/6J的受精卵中，用129做假孕受体，制备转基因小鼠。转基因小鼠提取鼠尾DNA进行基因鉴定（h-PSGL-F: 5’-CTACCAAAAGAGGTCTGTTC-3’；h-PSGL-R: 5’-ATGAGATGCAGACCATCTCG-3’），采用RT-PCR法检测组织内基因表达情况（h-PSGL-CF: 5’-GTGGTGCTGGCGGTCCG-3’；h-PSGL-CR: 5’-CAGGCCCCCATTGGCTGTG-3’），并用兔抗人PSGL-1的多克隆抗体检测组织内蛋白表达情况。

（2）病毒制备：使用的临床分离株包括：1.FY0805a，2008年分离自安徽省阜阳市，GenBank存储号为HQ882182；2.JK2009,2009年分离自重庆市，GenBank存储号为HQ694982；使用的小鼠适应株为MP10，为FY0805a在小鼠体内连续传代10次后的小鼠适应株，GenBank存储号为HQ712020。EV71在人横纹肌瘤细胞（RD）中培养、繁殖，采用三次冻融法释放病毒，超速离心法富集病毒，病毒储存于超低温冰箱中，病毒储存液浓度为1×109 TCID50/ml。

（3）实验动物：可使用SPF级别的10日龄乳鼠，品系为C57BL/6J-TgN(CMV-Homo-PSGL-1) -ZLFILAS，母鼠自然哺乳，在动物生物安全二级实验室内独立饲养。

（4）病毒感染：根据预实验确定感染剂量，10日龄乳鼠经轻度麻醉后，经腹腔注射1×108 TCID50 的EV71JK2009,攻毒体积为100微升/只；小鼠适应株EV71 MP10的感染剂量为5×106 TCID50，注射体积为100微升/只，空白对照组注射等量RD细胞上清。

（1）转基因小鼠鉴定：

人PSGl-1转基因小鼠经RT-PCR和Western blotting鉴定，表明人PSGL-1蛋白主要在小鼠的骨骼肌和脑中表达，可检测到该基因的mRNA表达及蛋白（图1）。

（2）动物症状：

EV71 MP10感染转基因小鼠后，动物自感染后第3天开始出现症状，表现为体重增长变缓、弓背竖毛、后肢行动迟缓至瘫痪、死亡等症状。感染后第4天时，动物全部表现出后肢瘫痪、停止进食等症状，感染后第5天动物开始出现死亡，在10天内全部死亡，该特征类似于EV71重症感染小鼠模型。实时荧光定量PCR检测表明病毒主要复制部位为骨骼肌和脑，病毒在感染后第3天达到高峰，主要病理表现为坏死性肌炎。

图1. 人PSGL-1转基因小鼠鉴定.A，人PSGL-1基因设计；B，转基因小鼠基因型鉴定；C，骨骼肌和脑内人PSGL-1基因的mRNA检测；D，Western blotting检测骨骼肌和脑内人PSGL-1蛋白表达检测。

（3）转基因小鼠与野生小鼠模型的区别

制作人PSGL-1转基因小鼠的主要目的，是验证表达人PSGL-1蛋白能否提高小鼠对EV71的敏感性，因此，可通过EV71的临床分离株和小鼠适应株来分别测验人PSGL-1对EV71感染的促进效果。

图2. EV71临床分离株JK2009感染人PSGL-1转基因小鼠和野生型小鼠后，病毒在骨骼肌中的复制曲线。● 野生型小鼠；○ 转基因小鼠。

   EV71的临床分离株JK2009感染小鼠后，分别在第1天、3天和5天分离骨骼肌，检测病毒载量，发现与野生型小鼠相比，转基因小鼠骨骼肌内的病毒载量并没有显著提高（图2）。

EV71的小鼠适应株MP10感染小鼠后，在第3天时，转基因小鼠的骨骼肌、脊髓和脑内的病毒载量显著高于野生型小鼠（图3A-C），但是在第5天时，该差别不再明显，表明表达人PSGL-1蛋白可以一过性的促进EV71小鼠适应株感染小鼠。与病毒复制相一致，第3天转基因小鼠的后肢出现双侧瘫痪，症状明显比野生型小鼠严重，但在第5天时症状类似（图3D-E）。提高病毒的感染剂量，并不能使两周以上的转基因小鼠表现出明显的症状，表明人PSGL-1具有一定的促进EV71感染效果。

图3. EV71的小鼠适应株MP10感染转基因小鼠和野生型小鼠. A-C，组织内病毒载量，A（骨骼肌），B（脊髓），C（脑）；D，临床症状评分的变化曲线；E，感染第3天和第5天时的小鼠状态照片。