BALB/C小鼠

根据前期预实验结果确定攻毒量，建立重症EV71小鼠模型，9日龄BALB/c乳鼠轻度麻醉后，经腹腔注射10^4.5 TCID₅₀临床分离株NX10-147 (GenBank登录号KJ004556，分离于2010年宁夏)，攻毒剂量为250 μl/只；空白对照组乳鼠(n=12)腹腔注射等量RD细胞上清，其中3只取其血清作为对照组血清。分别在3、6、12 hpi 和1、2、3、5、7、9 dpi采集每组各3只乳鼠血清以备检测血清中的细胞因子。在3 dpi和5 dpi每组各剖杀3只乳鼠，立即取其脑干、脊髓、肺脏、后肢骨骼肌和空肠固定在4 %多聚甲醛中，以备组织病理学检测；同时，每组另剖杀3只乳鼠取以上组织冻存，以备病毒RNA提取和组织内病毒载量测定。临床症状观察共持续14天。

（1）EV71 NX10-147 腹腔感染BALB/c小鼠建立重症EV71小鼠模型

采用病毒滴度为10^4.5 TCID₅₀/ml的EV71（NX10-147）经腹腔注射感染9日龄BALB/c乳鼠，建立重症小鼠模型，6 dpi重症模型小鼠发生后肢瘫痪最终导致死亡；绘制生存率（图1A），体重增长曲线（图1B），临床评分（图1C）。重症小鼠模型在5 dpi时，2/7(28.57%)小鼠发生后肢瘫痪（图2），在7 dpi时，4/7(57.14%)小鼠表现瘫痪，其体重也下降，11~12 dpi重症小鼠出现死亡，生存率为71.43%(5/7)，其中存活的小鼠中60%(3/5)出现瘫痪后遗症。

图1. EV71毒株（NX10-147）经腹腔注射感染乳鼠建立重症小鼠模型的生存率、体重、临床评分

A. 生存率; B. 体重; C. 临床评分

图2. EV71 NX10-147 腹腔感染BALB/c小鼠主要症状

（2）EV71 NX10-147 腹腔感染BALB/c小鼠各组织病毒载量检测

为了进一步探讨重症EV71小鼠模型体内病毒载量情况，采用RT-PCR对3 dpi和5 dpi重症小鼠脑、脊髓、骨骼肌、空肠和肺组织进行病毒核酸检测（图3），发现以上各组织在3 dpi和5 dpi 均检测到EV71病毒，其中，检测到重症模型3 dpi骨骼肌中的高病毒载量（10^7.0 copies/mg），其中，3 dpi 在重症模型脑组织中均检测到低病毒载量(10^2.0 copies/mg)，5 dpi脑组织中病毒载量增加到10^4.0 copies/mg，说明5 dpi EV71病毒造成中枢神经系统感染加重。3 dpi在重症模型脊髓、空肠和肺组织中的病毒载量10^4.0 copies/mg，5 dpi 病毒载量无明显变化，重症小鼠模型中均检测到骨骼肌和脊髓中较高的病毒载量，说明这些组织是病毒复制并传播到脑组织的重要部位。

图3. EV71 NX10-147 腹腔感染BALB/c小鼠的组织内病毒载量

（3）EV71 NX10-147 腹腔感染BALB/c小鼠组织病理学变化

    运用组织病理学和免疫组织化学技术，对重症小鼠模型的各组织器官进行病理学观察。空白对照组小鼠未见明显病理变化，并且EV71抗原呈阴性反应。

对重症小鼠模型（NX10-147）进行组织病理学观察（图4），发现3 dpi和5 dpi 小鼠后肢骨骼肌发生严重的坏死性肌炎，肌纤维断裂，大量炎性细胞浸润，主要有淋巴细胞、嗜中性粒细胞、巨噬细胞；3 dpi 小鼠脊髓和脑干发生细胞源性水肿，神经元发生变性，偶见坏死，5 dpi小鼠脊髓前角运动神经元变性坏死，出现红色神经元，并可见卫星现象和嗜神经现象，脑干组织中的神经元发生不同程度的变性坏死，并且可见脑干和脊髓神经元中的尼氏小体消失；5 dpi肺脏发生大面积间质性肺炎，间质增宽，炎性细胞浸润，肺泡间隔毛细血管淤血，3 dpi和5 dpi肺脏发生局灶性肺气肿；3 dpi和5 dpi空肠黏膜上皮细胞发生大面积空泡变性。免疫组织化学检测发现在上述严重病变的组织中可观察到EV71特异性抗原分布（图5），在3 dpi和5 dpi时，脊髓、脑干、空肠和骨骼肌检测到较强的阳性EV71抗原信号，提示在这些组织中病毒复制活跃，然而在5 dpi时，肺脏检测到中等强度阳性EV71抗原信号。

图 4. 重症小鼠模型各组织的组织病理学检测

图注：9日龄BALB/c乳鼠腹腔注射104.5 TCID50 EV71毒株（NX10-147），3 dpi和5 dpi解剖取材，图片显示各组别的典型组织照片（×200），箭头指示5 dpi各组织典型病理变化，对照组小鼠组织未见明显病理变化。

图5. EV71 NX10-147 腹腔感染BALB/c小鼠各组织中EV71 VP2蛋白的检测

图注：重症小鼠的骨骼肌、脊髓、脑干、肺以及空肠组织中可检测到阳性EV71抗原（棕黄色颗粒）（×200），在空白对照组的上述组织中未见阳性EV71抗原。

（4）EV71 NX10-147 腹腔感染BALB/c小鼠血清细胞因子检测

    对重症小鼠模型进行血清细胞因子检测从血清细胞因子方面揭示重症发生机制。本研究采用CBA方法检测了重症小鼠的3、6、12 hpi 以及1、2、3、5、7、9 dpi的血清细胞因子IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13、TNF-α、IFN-γ，以及MCP-1、CCL5/RANTES的动态变化（图6）。结果发现，这些血清因子中，IL-5、IL-13、IL-6、MCP-1、CCL5、TNF-α在重症小鼠中发生某时间点的爆发性浓度增高，与空白对照组小鼠血清因子相比，发现重症小鼠血清爆发性增高的细胞因子分别是3 hpi重症IL-5上调4倍；48 hpi重症IL-13上调1.2倍；3 dpi重症IL-6、MCP-1都上调100倍以上；3 dpi和7 dpi重症CCL5/RANTES分别上调9倍和10倍；重症小鼠模型中的IFN-γ在5 dpi时达到峰值，重症为10倍；7 dpi重症TNF-α和MCP-1分别上调4倍和87倍。以上数据说明，IL-5和IL-13可能是EV71小鼠实验感染早期炎症反应的主要因素，并且细胞因子IL-6、TNF-α、IFN-γ、MCP-1、CCL5/RANTES在重症EV71实验感染的免疫病理损伤中发挥重要作用。

图6. 动态检测重症小鼠血清中的炎性细胞因子变化

图注：流式细胞小球微阵列术（CBA）检测血清中细胞因子浓度变化：A. IL-5; B. IL-13; C. IL-6; D. MCP-1; E. CCL5/RANTES; F. TNF-α; G. IFN-γ. 感染后出现因子浓度变化倍数比较显示在图H中。