SD大鼠

3.1 实验材料

3.1.1 实验动物

SD大鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司【SCXK（京）2012-001】。实验中涉及动物的操作程序已获得中国医学科学院医学实验动物研究所实验动物使用与管理委员会的批准，批准号为ZLF18003.

3.1.2实验仪器

3.1.3实验试剂

3.1.4模型构建流程

利用Cre/loxP重组系统的原理，进行条件性敲除（Conditional knockout，CKO），制备心肌组织特异性Isca1敲除大鼠。在Isca1基因第三外显子两端插入两个loxP位点来构建Isca1^flox/+大鼠，使其与αMHC-Cre大鼠进行杂交，经两轮杂交最终获得Isca1^flox/flox/MHC-Cre大鼠，并使用PCR方法进行基因型鉴定，使用Western blot技术进行敲除效率的鉴定。

3.1.5 Isca1条件性敲除大鼠及心肌组织特异性Isca1敲除大鼠的建立

3.1.5.1 Isca1条件性敲除大鼠模型的建立

1. 
   设计方案

图 1. Isca1条件性敲除模型构建设计方案

2. 构建sgRNA 载体pUC57-sgRNA expression vector，根据基因信息选择靶点并合成sgRNA。

靶点1:

GCCTCCTGAGCAAGTGCT   GGG

R-ISCA1-gRNA UP1        5’TAGGGCCTCCTGAGCAAGTGCT

R-ISCA1-gRNA DOWN1    5’AAACAGCACTTGCTCAGGAGGC

靶点2:

AGCCCTGAACTCCTTATG   TGG

R-ISCA1-gRNA UP2        5’TAGGAGCCCTGAACTCCTTATG

R-ISCA1-gRNA DOWN2    5’AAACCATAAGGAGTTCAGGGCT

3. 合成的sgRNA单链通过退火复性结合成小片段，插入BSA I线性化的载体，构建完成的sgRNA载体通过体外转录成为可注射的sgRNA。
4. 构建Cas9载体pST1374-NLS-flag-linker-Cas9，载体通过体外转录成为可注射的Cas9-RNA。
5. 显微注射

1. 超数排卵：15只3-4周龄SD雌鼠注射激素进行超排。
2. 受精卵注射：取约150枚受精卵进行注射。
3. 雄鼠结扎：制作30只8周龄输精管结扎的SD雄鼠。
4. 受体鼠制备：8-10周龄SD雌鼠与结扎的SD雄鼠交配后选取见栓的雌鼠。
5. 胚胎移植：将注射后的受精卵移植到受体鼠输卵管壶腹部（移植一次，150枚卵，5只受体鼠）。

6. 基因型鉴定

1. 剪尾编号：出生7-10天的乳鼠，剪取脚趾和尾尖进行编号及取材。
2. 基因组DNA提取：使用基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA
3. PCR检测：根据序列信息设计检测引物并进行PCR检测。

7. 结果分析：选取通过PCR检测后含有不同于野生型分子量条带的鼠号，将PCR产物进行TA克隆，之后用检测引物进行菌液PCR，筛选有插入的克隆测序。
8. 根据测序结果确定Isca1条件性敲除模型大鼠（SD. Isca1 (tm-loxp)-GC/ILAS，http://www.ratresource.com）用于后续实验。

3.1.5.2 心肌组织特异性Isca1敲除大鼠（Isca1^flox/flox/MHC-Cre）的建立

根据3.1.5.1获得Isca1^flox/+大鼠F1代后，首先通过8周龄左右Isca1^flox/+与野生型大鼠进行杂交，获得一定数量的Isca1^flox/+大鼠。与此同时使8周龄左右Isca1^flox/+大鼠与αMHC-Cre大鼠（SD. Tg(MHC-CRE)-GC/ILAS，http://www.ratresource.com）进行杂交，得到Isca1^flox/+/MHC-Cre大鼠。之后使8周龄左右Isca1^flox/+大鼠与Isca1^flox/+/MHC-Cre大鼠进行第二轮杂交，可得到Isca1^flox/flox/MHC-Cre大鼠，即心肌组织特异性Isca1敲除纯合子大鼠，用于后续实验。

图 2. Isca1^flox/flox/MHC-Cre大鼠的繁育

3.1.5.3 鼠尾基因组DNA提取

在幼崽出生后剪脚趾标记，收集幼崽脚趾至1.5 mL EP管。然后参照DNA提取试剂盒说明书按以下程序操作。

1. 加入100 μL LB2和20 μL Proteinase K，55℃摇床孵育至完全裂解。
2. 12000 rpm 离心5 min，转移上清于一无菌的离心管中。
3. 加入500 μLBB2，立即涡旋5 s，室温孵育10 min。
4. 将全部的溶液加入离心柱中，8000 rpm离心1 min，弃掉流出液。
5. 加入500 μL CB2溶液，12000 rpm离心1 min，弃掉流出液。
6. 重复步骤（5）一次。
7. 加入500 μL WB2（使用前加入88 mL无水乙醇），12000 rpm 离心1 min，弃掉流出液。
8. 重复步骤（7）一次。
9. 10000 rpm 离心2 min，彻底去除残留的WB2。

将离心柱置于一干净的离心管中，开盖静置5 min，在柱的中央加入50~200 μL预热EB（60℃~70℃），盖上盖子，室温静置3 min，12000 rpm 离心2 min，洗脱DNA。保存至4℃冰箱。

4.1 心肌组织特异性Isca1敲除大鼠模型的建立

利用Cre/loxP重组系统的原理，进行条件性敲除（Conditional knockout，CKO），制备心肌组织特异性Isca1敲除大鼠。在Isca1基因第三外显子两端插入两个loxP位点来构建Isca1^flox/+大鼠，使其与αMHC-Cre大鼠进行杂交，经两轮杂交最终获得Isca1^flox/flox/MHC-Cre大鼠，通过PCR方法进行基因型鉴定心肌组织特异性Isca1敲除大鼠基因型。免疫印迹Western blot方法鉴定Isca1^flox/flox/MHC-Cre大鼠ISCA1蛋白的敲除效率达90%以上（图3）。

图3 心肌组织特异性Isca1敲除大鼠模型基因型鉴定及基因蛋白表达水平鉴定

4.2 心肌组织特异性Isca1敲除大鼠生存率分析

为观察心肌组织特异性Isca1敲除大鼠子代基因型及生存率情况，将 Isca1^flox/+大鼠与MHC-Cre大鼠经两代杂交，得到野生型（WT）、心肌特异性Isca1敲除大鼠杂合子（Isca1^flox/+/MHC-Cre）和心肌特异性Isca1敲除大鼠纯合子（Isca1^flox/flox/MHC-Cre）幼崽，根据孟德尔定律，上述基因型比例应为5：2：1，实验结果显示，累积统计幼崽共127只，其中WT幼崽74只，Isca1^flox/+/MHC-Cre 幼崽37只，Isca1^flox/flox/MHC-Cre幼崽16只，经计算可得子代中野生型、杂合子型、纯合子型三种基因型幼崽出生比例基本符合孟德尔定律（图4）。对三种基因型子代进行生存率分析显示，子代中WT和Isca1^flox/+/MHC-Cre幼崽生存正常，生存率为100%，Isca1^flox/flox/MHC-Cre幼崽7~10天全部死亡，至11天生存率为0%（图4）。

图4 心肌组织特异性Isca1敲除大鼠生存率分析

注：（A）Isca1^flox/+大鼠与Isca1^flox/+/MHC-Cre大鼠杂交后，出生子代基因型情况统计。（B）Isca1^flox/+大鼠与Isca1^flox/+/MHC-Cre大鼠杂交后，WT和Isca1^flox/flox/MHC-Cre子代生存率统计。

4.3 心肌组织特异性Isca1敲除大鼠心脏重量/体重比分析

使 Isca1^flox/+大鼠与Isca1^flox/+/MHC-Cre大鼠杂交，于子代出生后6.5天对WT和Isca1^flox/flox/MHC-Cre（CKO）子代进行大体形态观察并计算心脏重量与体重之比（heart weight/body weight，HW/BW）。实验结果，与野生型相比，6.5 d CKO大鼠呼吸虚弱，处于濒临死亡状态（图5），并且心脏外观出现明显肥大。6.5 d CKO大鼠HW/BW平均值±标准差为（8.11 ± 1.85）mg/g，较6.5 d WT大鼠（平均值±标准差为（6.50 ± 1.01） mg/g）显著增加，有显著性差异（图5，*P<0.05）。

图 5 心肌组织特异性Isca1敲除大鼠HW/BW比率分析

4.4  M型超声心动图检测6.5 d心肌特异性Isca1敲除大鼠心脏的结构和功能

为分析心脏结构与功能状态改变，本研究通过M型超声心动图检测6.5 d 野生和心肌组织特异性敲除大鼠心脏的结构和功能。发现与同窝WT大鼠相比，6.5 d KO大鼠射血分数大幅下降，左心室内径明显增大，伴随室壁变薄，表现为收缩无力，心室严重扩张，已出现心功能下降、严重心衰的症状。

表1.  6.5 d心肌组织特异性Isca1敲除大鼠心脏M型超声影像参数分析

注：左心室舒张末期内径（left ventricular end-diastolic diameter，LVID;d）；左心室收缩末期内径（left ventricular end-systolic diameter，LVID;s）；射血分数（ejection fraction，EF）；短轴缩短率（fractional shortening，FS）；舒张期左心室后壁厚度（left ventricular posterior wall; diastolic，LVPW;d）；收缩期左心室后壁厚度（left ventricular posterior wall; systolic，LVPW;s）；舒张期左心室前壁厚度（left ventricular anterior wall; diastolic，LVAW;d）；收缩期左心室前壁厚度（left ventricular anterior wall; systolic，LVAW;s）。*P<0.05，**P<0.01，versus同窝WT大鼠。

4.5 心肌组织特异性Isca1敲除大鼠心肌纤维及线粒体形态观察

为进一步分析心肌组织特异性Isca1敲除大鼠心肌纤维和线粒体形态改变，取6.5 天WT和心肌组织特异性Isca1敲除大鼠，摘取心脏，取左心室2 mm×2 mm大小新鲜组织，使用电镜专用固定液进行固定，制备电镜样本并进行观察。结果显示，WT大鼠心肌纤维排列整齐，肌节和Z线清晰，心肌内线粒体多呈圆形或椭圆形，线粒体双层膜膜结构清晰，嵴致密。而6.5 天心肌组织特异性Isca1大鼠敲除心肌纤维出现断裂，肌节和Z线严重模糊，部分位置纤维已溶解，心肌内线粒体膜结构受损，线粒体内嵴结构消失，线粒体肿胀及空化严重（图6）。

图6心肌组织特异性Isca1敲除大鼠超微结构形态观察