SD大鼠生长发育快，适应性和抗病能力强，易发生代谢综合征。容易获得，价格较低，常是基因工程大鼠的首选实验动物。

实验动物：

8-10周龄SD雄性大鼠，用作种公鼠和结扎公鼠；4-6周龄雌性大鼠，用作超数排卵，8~10周龄雌性大鼠，用作受体。

主要试剂：

孕马血清促性腺激素(PMSG)，人绒毛膜促性腺激素(hCG)，M2培养液(M7167，Sigma)，M16培养液(M7292，Sigma)，体外转录试剂盒(Ambion)，PCR试剂盒(Takara)，luciferaseSSA检测试剂盒，琼脂糖等

主要仪器：

低温超速离心机，PCR仪，电泳仪，Leica体视镜，显微注射系统，超净工作台，培养皿(BD Falcon)，一次性注射器，无菌手术器械(剪刀、镊子、血管夹、持针器、手术缝线等)等

实验环境：

普通实验室内进行质粒构建与显微注射。SD大鼠饲养于SPF屏障环境。

实验操作规程：

1. 供体与受体准备

供体雌鼠超数排卵：选择 4-6 周龄的雌鼠，于腹腔注射 PMSG 20 IU/只，48 h后注射hCG 20 IU/只，按1:1的比例与成年雄鼠合笼，于次日早上观察雌鼠阴栓，见栓雌鼠取卵用于显微注射。雄鼠结扎：选8-10周龄雄性大鼠，腹腔注射戊巴比妥钠(40 mg/kg体重)麻醉后剪毛，75%酒精消毒，腹中线下方距阴茎2-3 cm处剪开皮肤肌肉，分别分离出两侧输精管，将镊子在酒精灯上加热后烧断输精管，关闭腹腔，待恢复2周后用于和雌鼠交配准备受体。受体假孕鼠制备：于取卵前1 d选择成年雌鼠与结扎雄鼠合笼，次日早上观察雌鼠阴栓，见栓雌鼠即作为假孕鼠用作受精卵移植。

2. TALEN 质粒的准备

TALEN设计靶位点位置: exon2上，kinase 的domain 前5’-T GGACACACGACGTTGGC agggcttccgcctgga GGATTATCTGATAGGAC A-3’。将构建的 TALEN质粒对分别取 10 µg 酶切线性化，酚氯仿抽提、纯化后取 1 µg 作模板，按照体外转录试剂盒的说明依次加入 NTP/CAP、10×Buffer 及 Enzyme Mix，最后加水至20 µl转录体系，于37℃水浴2 h。转录后纯化、鉴定，分装保存于-80℃冰箱。

图1. 组装后的TALEN质粒。

3. 胚胎收集

将见栓雌鼠颈椎脱臼处死，75%酒精消毒后迅速剪开腹腔，分离卵巢输卵管和子宫，剪下输卵管置于37℃预热的M2液滴中，在体式镜下将输卵管膨大部划开，释放出卵丘-卵母细胞复合体。透明质酸酶消化去除颗粒细胞后，于M2培养液滴中洗3-5次后，移入覆盖有矿物油的M16培养液中培养以备显微注射。

4. 显微注射

显微镜下观察可见清晰原核的卵细胞为受精卵，挑选出用于显微注射。将TALEN质粒对转录的mRNA中放入注射针虹吸，注射针尖端充满液体后安装于注射仪上，根据注射针的出液量多少调节注射压力，注射后可见胞质有明显膨胀表明成功注射入胞质。将成功注射且存活的受精卵用于输卵管移植。

5. 输卵管移植

将见栓的假孕鼠戊巴比妥钠腹腔注射麻醉(40 mg/kg体重)，背部脊柱两侧肋骨下方剃毛，75%酒精消毒后依次剪开皮肤肌肉，可见白色脂肪体，用镊子夹住脂肪体向外牵拉出卵巢、输卵管、子宫，在体视镜下找到输卵管膨大部，用血管夹夹住脂肪体以固定输卵管在镜下合适的位置，在输卵管膨大部前方避开血管走形剪开一小口，将移卵管插入开口吹入胚胎，液体后方吹入一气泡防止液体反流。将脂肪体、卵巢、输卵管及子宫还纳入腹腔，缝合肌肉皮肤。

6. 出生大鼠鉴定 将受精卵移植的假孕鼠

单笼饲养22 d左右后观察乳鼠出生情况。新生鼠生长至 1 周以上即剪脚趾，消化液 55℃水浴消化过夜后，常规方法提基因组。对目的基因进行 PCR 扩增后送测序鉴定。

动物伦理：

用于实验的SD大鼠购自维通利华，饲养于SPF屏障环境。饲养条件为温度(24±2)℃，湿度为(50±10)%，光照周期为6:00~18:00，12 h昼夜交替。本实验中动物的使用已获得中国医学科学院医学实验动物研究所实验动物使用与管理委员会（ICUC）批准（QC18011）。

出生7天内的大鼠剪鼠尾进行基因型鉴定（图2），引物序列Pink1-sens 5’-GACTGTCTTAGACAGTGAGGCAG-3’；Anti 5’-CCAGTCCTCAAAGACCATCCTTAC-3’，产物大小448bp。PCR体系与程序见下表1，扩增产物进行测序（16个碱基缺失，图3）。

表1. PCR扩增体系与条件

图3. PCR产物的测序结果显示Pink1 KO大鼠缺失的碱基

寡核苷酸序列：Pink1 sense: 5’-CATGGCTTTGGATGGAGAGT-3’; antisense: 5’-TGGGAGTTTGCTCTTCAAGG-3’。

图4. Pink1 KO大鼠PINK的mRNA水平（A）和蛋白水平（B，50/60KD）

PINK1抗体（CST，#6946） 进行WesternBlot鉴定（图4B）。

    大体解剖并未发现大鼠各脏器有明显异常。

5.影像学

PET结果显示于对照组相比，PINK1敲除大鼠纹状体的葡萄糖摄取率下降（图5）。

图5. PET显示Pink1 KO大鼠纹状体的葡萄糖摄取率下降。（A）纹状体的代表性图片；（B）为不同脑区包括纹状体（STR）、黑质（SN）、前额叶（PFC）、颞叶（TC）和海马（Hip）的葡萄糖摄取率。

6.行为学

行为学结果显示大鼠出现运动异常和焦虑样行为。具体表现为：与同月龄同性别正常对照鼠相比，3月龄Pink1 KO雄鼠和雌鼠、6月龄雄鼠在旷场中心区的停留时间明显缩短（图6A），3月龄Pink1 KO雄鼠和6月龄雄鼠在高架十字迷宫实验时进入开放臂的时间百分比明显缩短（图6B）。提示Pink1 KO出现焦虑样行为。另外，6月龄Pink1 KO雌鼠前肢抓力下降（图6C），6月龄Pink1 KO雄鼠在转棒仪上所待的时间也明显减少（图6D）。提示Pink1 KO大鼠存在运动能力的异常。

图6. 行为学显示Pink1 KO大鼠出现运动障碍和焦虑样表现。（A）开放旷场实验；（B）高架十字迷宫实验；（C）抓力实验；（D）转棒实验。

7.病理表型

免疫组化检测显示PINK1敲除大鼠黑质内的多巴胺能神经元丢失（图7），α-synuclein的沉积和磷酸化水平的增加（图8）。线粒体超微结构和功能损伤（图9）。

图7. TH+染色显示Pink1 KO大鼠黑质内多巴胺能神经元减少。标尺：500μm

图8. 免疫组化显示Pink1 KO大鼠黑质内α-synuclein表达增多，纹状体内α-synuclein的磷酸化水平增加。上标尺：300μm，下标尺：100μm.

图9. Pink1 KO大鼠线粒体损伤。（A）电镜下线粒体超微结构损伤，空泡化（箭头），线粒体分裂增加。（B）Western Blot显示线粒体分裂蛋白Drp1表达明显增加。