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标识符 CSTR:16397.09.0A01001028
资源中文名称 C9ORF72基因敲除大鼠
资源英文名称 C9ORF72 knockout rat
疾病概述   肌萎缩侧索硬化(ALS)也叫运动神经元病(MND),后一名称英国常用,法国又叫夏科(Charcot)病,而美国也称卢伽雷(Lou Gehrig)病。我国通常将肌萎缩侧索硬化和运动神经元病混用。它是上运动神经元和下运动神经元损伤之后,导致包括球部(所谓球部,就是指的是延髓支配的这部分肌肉)、四肢、躯干、胸部腹部的肌肉逐渐无力和萎缩。患病率约为4-6/10万。大约10%的ALS病例是家族型的,90%是散发型的。   2018年5月11日,国家卫生健康委员会等5部门联合制定了《第一批罕见病目录》,肌萎缩侧索硬化被收录其中。
实验动物背景信息

SD大鼠

模型制作方法

3.1 实验材料

3.1.1 实验动物

SD大鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司【SCXK(京)2012-001】。实验中涉及动物的操作程序已获得中国医学科学院医学实验动物研究所实验动物使用与管理委员会的批准,批准号为ZLF18003.

3.1.2实验仪器

仪器及耗材

生产厂商

NanoZoomer S60数字病理切片扫描仪

日本滨松光子学株式会社

Vevo770小动物超声影像系统

VisualSonics

激光共聚焦扫描显微镜

Leica

透射电子显微镜

JEOL

显微注射仪

Nikon

光学显微镜

Nikon

化学发光凝胶成像系统

BIO-RAD

PCR仪

BIO-RAD

组织脱水机

Leica

石蜡切片机

Leica

石蜡包埋机

Leica

冰冻切片机

Leica

电泳仪

BIO-RAD

电泳槽

Tanon

数码凝胶图像处理系统

Tanon

组织匀浆机

POLYTRON

恒温培养箱

温控振荡箱

Incucell

TAITEC

离心机

Eppendorf

摇床

SCILOGEX

塑料薄膜封口机

德清拜杰有限公司

电动鼓风干燥箱

天津市泰斯特仪器有限公司

电子称量器(量程0.5g-620g)

奥豪斯仪器(常州)有限公司

电子称量器(量程0.1mg-220g)

Sartorius

4℃冰箱

海尔集团

-80℃冰箱

SANYO

-20℃冰箱

SANYO

涡旋振荡器

上海沪西分析仪器厂

移液器

Eppendorf

 

3.1.3实验试剂

试剂

生产厂商

体外转录用试剂盒

Ambion

Taq DNA聚合酶

TaKaRa

T7 转录试剂盒

Invitrogen

T4 DNA裂连接

TaKaRa

胶回收试剂盒

Qiagen

质粒提取试剂盒

Axygen

Trizol试剂

Invitrogen

逆转录试剂盒

DNA提取试剂盒

Invitrogen

北京全式金生物科技有限公司

C9orf72(66140-1-lg)抗体

proteintech

Purified Mouse Anti-GM130(610822)     

BD

Anti-Giantin antibody (ab37266)

Abcam

Anti-Rab5 antibody (ab18211)

Abcam

Anti-RAB7 antibody (ab137029 )

Abcam

Anti-Rab11 antibody (ab3612)

Abcam

      Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 (A11029 ) 

Invitrogen

Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 (A21424 )

Invitrogen

   Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 (A31572) 

Invitrogene

GADPH

Santa Cruz Biotechnology

NC膜

Millipore

化学发光液

Immuno Cruz

蛋白质分子量标记物

Takara

蛋白酶抑制剂

罗氏

组织裂解液

Thermo

丽春红

Beyotime

BCA试剂盒

Beyotime

Western blot 洗液(10×)

Beyotime

30%Acr-Bis

Beyotime

SDS-PAGE电泳液

Beyotime

Western blot转膜液(粉剂)

Beyotime

TEMED

Beyotime

过硫酸铵

Beyotime

1.5 M Tris·HCl(pH=8.8)缓冲液

Beyotime

1 M Tris·HCl(pH=6.8)缓冲液

Beyotime

琼脂

BD公司

异丙醇

北京化工厂

脱脂奶粉

内蒙古伊利实业集团股份有限公司

 

3.1.4模型构建流程

  1. 设计方案

  1. 构建sgRNA 载体pUC57-sgRNA expression vector,根据基因信息选择靶点并合成sgRNA。

靶点1:

ccC   caccatctcctgctgttg

靶点2:

aacggagatcggagcactta   cgg

  1. 合成的sgRNA单链通过退火复性结合成小片段,插入BSA I线性化的载体,构建完成的sgRNA载体通过体外转录成为可注射的sgRNA。
  2. 构建Cas9载体pST1374-NLS-flag-linker-Cas9,载体通过体外转录成为可注射的Cas9-RNA。
  3. 显微注射
  1. 超数排卵:15只3-4周龄SD雌鼠注射激素进行超排。
  2. 受精卵注射:取约150枚受精卵进行注射。
  3. 雄鼠结扎:制作30只8周龄输精管结扎的SD雄鼠。
  4. 受体鼠制备:8-10周龄SD雌鼠与结扎的SD雄鼠交配后选取见栓的雌鼠。
  5. 胚胎移植:将注射后的受精卵移植到受体鼠输卵管壶腹部(移植一次,150枚卵,5只受体鼠)。
  1. 基因型鉴定
  1. 剪尾编号:出生7-10天的乳鼠,剪取脚趾和尾尖进行编号及取材。
  2. 基因组DNA提取:使用基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA
  3. PCR检测:根据序列信息设计检测引物并进行PCR检测。
  1. 结果分析:选取通过PCR检测后含有不同于野生型分子量条带的鼠号,将PCR产物进行TA克隆,之后用检测引物进行菌液PCR,筛选有插入的克隆测序。

根据测序结果确定C9ORF72基因敲除模型大鼠(SD. C9ORF72 (tm)-GC/ILAS,http://www.ratresource.com)用于后续实验。

模型表型数据

1,C9ORF72基因敲除大鼠的建立

 

2,C9ORF72基因敲除和兴奋毒性共同诱导运动缺陷

3,C9ORF72基因敲除和兴奋毒性联合作用导致运动神经元丢失

4,C9ORF72基因敲除大鼠脊髓免疫荧光染色分析

5,兴奋毒性诱导与不诱导的WT和C9orf72敲除大鼠脊髓细胞RNA测序分析

动物模型的评价与验证
保存方式 冷冻保存、活体繁殖
合作方式
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备注