C57BL/6小鼠

包括实验材料（实验动物、试剂、仪器）、实验环境、细胞培养/载体构建/蛋白表达/病原培养鉴定方法、实验操作规程、动物处理伦理等内容。

（一）巨噬细胞上特异性小鼠制备的原理

条件性基因敲除小鼠的设计利用了位点特异性重组酶系统Cre/LoxP原理，需要在待敲除的一段目标DNA序列的两端各放置一个loxP序列，得到flox(flanked by loxP)小鼠。将flox小鼠与带有组织或细胞特异性表达cre的小鼠交配繁殖，以获得在特定细胞或者组织里把目的基因敲除掉的小鼠，即条件性基因敲除小鼠。

如下图：

图1 特异性敲除的原理

（二）条件敲除小鼠的繁殖和鉴定

1.  收到F0和F1小鼠后，首先确认每只小鼠的脚趾编号是否吻合。

2.  F0和F1小鼠由于数量较少，以后需要的动物多，与野生交配，尽量多繁殖，以备后续的研究。

3. 获得小鼠后，提取基因组DNA，PCR扩增，进行基因型鉴定，并利用流式进行表型鉴定。

4. 繁殖方法有多种，以下为一种举例：

首先将PD-L1^Flox/-小鼠和C57BL/6小鼠进行杂交，得到PD-L1^Flox/-小鼠，然后将PD-L1^Flox/-小鼠进行自交，得到PD-L1^Flox/Flox小鼠，将雌性PD-L1^Flox/Flox小鼠和带有巨噬细胞特异性表达 Cre 酶的Lyz2-iCre雄鼠进行杂交，得到 PD-L1^Flox/- with Cre小鼠，最后将PD-L1^Flox/Flox小鼠和PD-L1^Flox/- with Cre小鼠杂交，得到1/4的PD-L1^Flox/Flox with Cre小鼠，即为巨噬细胞特异性PD-L1敲除小鼠。

备注：PD-L1^Flox/-小鼠由中国医学科学院医学实验动物研究所基因工程平台采用CRISPR/Cas9技术构建。巨噬细胞特异性PD-L1敲除小鼠繁育过程所需的6周龄 SPF 级C57BL/6小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司【SCXK(京) 2018－001】，6周龄SPF级雄性Lyz2-iCre小鼠2只，购自南京大学模式动物中心。小鼠均饲养于中国医学科学院医学实验动物研究所屏障环境动物房【SYXK(京)2014－0029】，饲养间温度( 23 ± 2) ℃，12 /12 h 明暗交替照明，动物自由饮水及采食。动物实验中涉及动物的操作程序已经得到中国医学科学院医学实验动物研究所实验动物使用与管理委员会( IACUC) 的批准，批准号为 ZLJ19003。

      图2  PCR鉴定敲除小鼠的基因

2.1一般生物学特性： 

繁殖性能：产仔率：89～95％  平均窝产仔数：6.98～7.48只  胎间隔：28～36天  离乳存活率：87～93％

2.2 流式检测腹腔巨噬细胞、T细胞、B细胞PD-L1表达

    如下图所示，表明该小鼠模型的巨噬细胞上PD-L1是特异性敲除的。

图3 流式细胞术检测巨噬细胞、T和B细胞上PD-L1的表达

注：蓝色峰为Flox/+ with cre小鼠，红色峰为Flox/Flox with cre小鼠，绿色峰为Flox/Flox no cre小鼠

3、影像/行为/临床/病理表型