SD大鼠

包括实验材料（实验动物、试剂、仪器）、实验环境、细胞培养/载体构建//蛋白表达/病原培养鉴定方法、实验操作规程、动物处理伦理等内容。

3.1 实验材料

3.1.1 实验动物

SD大鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司【SCXK（京）2012-001】。实验中涉及动物的操作程序已获得中国医学科学院医学实验动物研究所实验动物使用与管理委员会的批准，批准号为ZLF18003.

3.1.2实验仪器

3.1.3实验试剂

3.1.4模型构建流程

在Epha4基因的启动子后插入一个报告基因mCherry，造成移码突变，实现基因敲除，制备Epha4基因敲除大鼠，并使用PCR方法进行基因型鉴定，使用Western blot技术进行敲除效率的鉴定。

3.1.5 Epha4敲除大鼠的建立

3.1.5.1 Epha4敲除大鼠模型的建立

1. 设计方案

图 1. Epha4敲除模型构建设计方案

2. 构建sgRNA 载体pUC57-sgRNA expression vector，根据基因信息选择靶点并合成sgRNA。

靶点1:

CCA   GCCTCCGGAGACCTTGAG

R-EPHA4-gRNA UP1      5’TAGGCTCAAGGTCTCCGGAGGC

R-EPHA4-gRNA DOWN1    5’AAACGCCTCCGGAGACCTTGAG

靶点2:

CCC   GGCGAATGAAGGTAAGAG

R-EPHA4-gRNA UP2      5’TAGGCTCTTACCTTCATTCGCC

R-EPHA4-gRNA DOWN2    5’AAACGGCGAATGAAGGTAAGAG

3. 合成的sgRNA单链通过退火复性结合成小片段，插入BSA I线性化的载体，构建完成的sgRNA载体通过体外转录成为可注射的sgRNA。
4. 构建Cas9载体pST1374-NLS-flag-linker-Cas9，载体通过体外转录成为可注射的Cas9-RNA。
5. 显微注射

1. 超数排卵：15只3-4周龄SD雌鼠注射激素进行超排。
2. 受精卵注射：取约150枚受精卵进行注射。
3. 雄鼠结扎：制作30只8周龄输精管结扎的SD雄鼠。
4. 受体鼠制备：8-10周龄SD雌鼠与结扎的SD雄鼠交配后选取见栓的雌鼠。
5. 胚胎移植：将注射后的受精卵移植到受体鼠输卵管壶腹部（移植一次，150枚卵，5只受体鼠）。

6. 基因型鉴定

1. 剪尾编号：出生7-10天的乳鼠，剪取脚趾和尾尖进行编号及取材。
2. 基因组DNA提取：使用基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA
3. PCR检测：根据序列信息设计检测引物并进行PCR检测。

7. 结果分析：选取通过PCR检测后含有不同于野生型分子量条带的鼠号，将PCR产物进行TA克隆，之后用检测引物进行菌液PCR，筛选有插入的克隆测序。
8. 根据测序结果确定Epha4敲除模型大鼠（SD.Epha4(tm-mCherry)-GC/ILAS，http://www.ratresource.com）用于后续实验。

3.1.5.2 Epha4敲除大鼠的建立

根据3.1.5.1获得Epha4^-/-大鼠F1代后，首先通过8周龄左右Epha4^-/-与野生型大鼠进行杂交，获得一定数量的Epha4^+/-大鼠。之后使8周龄左右Epha4^+/-大鼠进行第二轮杂交，可得到Epha4^-/-大鼠，用于后续实验。

3.1.5.3 鼠尾基因组DNA提取

在幼崽出生后剪脚趾标记，收集幼崽脚趾至1.5 mL EP管。然后参照DNA提取试剂盒说明书按以下程序操作。

1. 加入100 μL LB2和20 μL Proteinase K，55℃摇床孵育至完全裂解。
2. 12000 rpm 离心5 min，转移上清于一无菌的离心管中。
3. 加入500 μLBB2，立即涡旋5 s，室温孵育10 min。
4. 将全部的溶液加入离心柱中，8000 rpm离心1 min，弃掉流出液。
5. 加入500 μL CB2溶液，12000 rpm离心1 min，弃掉流出液。
6. 重复步骤（5）一次。
7. 加入500 μL WB2（使用前加入88 mL无水乙醇），12000 rpm 离心1 min，弃掉流出液。
8. 重复步骤（7）一次。
9. 10000 rpm 离心2 min，彻底去除残留的WB2。
10. 将离心柱置于一干净的离心管中，开盖静置5 min，在柱的中央加入50~200 μL预热EB（60℃~70℃），盖上盖子，室温静置3 min，12000 rpm 离心2 min，洗脱DNA。保存至4℃冰箱。

4.1 Epha4敲除大鼠模型的建立

图2 Epha4敲除大鼠模型基因型鉴定及基因蛋白表达水平鉴定

4.2 Epha4敲除大鼠生存率分析

对Epha4^-/-基因型和WT野生型进行生存率分析显示，WT生存正常，生存率为100%，Epha4^-/-生存率下降（图3）。

图3 Epha4敲除大鼠生存率分析

4.3 Epha4敲除大鼠心脏重量/体重比分析

对WT和Epha4^-/-进行大体形态观察并计算心脏重量与体重之比（heart weight/body weight，HW/BW）。实验结果，与野生型相比，2、6、9月龄Epha4^-/-大鼠心脏/体重比均无明显变化（图4）。2M WT大鼠HW/BW平均值±标准差为0.38 ± 0.035（%），KO大鼠0.393 ± 0.052（%）；6M WT大鼠HW/BW平均值±标准差为0.352 ± 0.024（%），KO大鼠0.0.369 ± 0.035（%）；9M WT大鼠HW/BW平均值±标准差为0.311 ± 0.043（%），KO大鼠0.338± 0.047（%）。从形态观察发现，Epha^-/-大鼠的心房与野生大鼠相比明显增大，计算心房重量与心脏重量比值（atrium weight/body weight, AW/HW）。实验结果显示，与WT相比，Epha4^-/-右心房/心脏重量比显著增加，2M WT大鼠右心房AW/HW平均值±标准差为5.939 ± 1.192（%），KO大鼠为7.112 ± 1.283（%）；6M WT大鼠右心房AW/HW平均值±标准差为4.655 ± 0.541（%），KO大鼠为6.892 ± 0.857（%），有显著性差异（图5，*P<0.05）；9M WT大鼠右心房AW/HW平均值±标准差为4.72 ± 0.936（%），KO大鼠为7.478 ± 0.681（%），差异非常显著（图5，**P<0.01）。

图 4 Epha4敲除大鼠HW/BW比率分析

图 5 Epha4敲除大鼠AW/HW比率分析

4.4  M型超声心动图检测Epha4敲除大鼠心脏的结构和功能

为分析心脏结构与功能状态改变，本研究通过M型超声心动图检测1、2、6、9四个月龄野生和敲除大鼠心脏的结构和功能。发现与同窝WT大鼠相比，自2M起，Epha4^-/-大鼠射血分数明显下降，差异显著（图6，*P<0.05，**P<0.01），而左心室内径、室壁均无明显变化（图6）。

图 6 Epha4敲除大鼠左心室结构功能分析

注：射血分数（ejection fraction，EF）；舒张期左心室前壁厚度（left ventricular anterior wall; diastolic，LVAW;d）；左心室舒张末期内径（left ventricular end-diastolic diameter，LVID;d）；、。*P<0.05，**P<0.01，versus同窝WT大鼠。

4.5磁共振成像分析Epha4敲除大鼠心房结构和功能

为进一步分析Epha4敲除大鼠心房的结构和功能，本研究通过核磁分析2、6、9月龄WT和Epha4敲除大鼠左右心房容积和射血分数。结果表明，与WT大鼠相比，Epha4敲除大鼠左右心房容积均无明显变化。但6、9月龄敲除大鼠心房射血分数与野生大鼠相比明显下降，6M组 WT左房射血分数为69.763±9.918（%），KO左房射血分数为47.35±7.458（%）；WT右房射血分数为69.123±14.592（%），KO右房射血分数为39.67±7.653（%）。9M组WT左房射血分数为52.738±10.739（%），KO左房射血分数为46.637±4.487（%）；WT右房射血分数为56.978±14.281（%），KO右房射血分数为32.967±2.492（%）（图7）。

图 7 Epha4敲除大鼠左右心房结构功能分析

4.6心电分析Epha4敲除大鼠心传导功能

从上面的结果我们已知，心房的改变发生在心室改变之前，为了进一步分析心房的电传导功能，我们对WT和Epha4敲除大鼠进行了心电图记录。结果显示，自1M起，敲除大鼠的心电出现了明显的改变，p波消失（图8），QRS波峰值增高，QT间期延长（图9，**P<0.01）。

图 8 Epha4敲除大鼠心电图记录

图 9 Epha4敲除大鼠心电指标分析