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CSTR:16397.09.0B01001448 登革病毒感染肝损伤小鼠模型 Liver injury mice model infected by dengue virus

登革病毒感染

病毒毒株 DENV NGC小鼠传代株N10。 实验动物 SPF级,4-6周,小鼠购自赛业生物技术有限公司和北京华阜康生物科技股份有限公司。于中国医学科学院医学实验动物研究所动物生物安全二级实验室(ABSL-2)中进行实验。实验动物的使用严格遵循3R原则,本实验得到了中国医学科学院医学实验动物研究所动物使用和管理委员会的批准(批准号为WW22001)。 模型建立 取100 μL病毒液(8×106 Copies/μL),尾静脉接种4-6周Ifnar1-/-小鼠。每日称重,观察。采取感染后第2、4、6、8天小鼠全血,并分离血清,检测血常规、病毒载量、细胞因子;分批安乐小鼠,采取肠、脾脏、肾脏、肝脏、脑等器官,用于病毒载量检测及组织病理学观察。

CSTR:16397.09.0E01001447 登革病毒感染附睾炎小鼠模型 Epididymitis mice model infected by dengue virus

登革病毒感染

病毒毒株 DENV NGC小鼠传代株N10 实验动物 6-8周SPF级Stat1-/-小鼠购自赛业生物科技有限公司,雌雄各半,体重18~22 g,品系名:C57BL/6J-Stat1em1C/Cya,遗传背景: C57BL/6J,基因型:Stat1-/-。于中国医学科学院医学实验动物研究所动物生物安全二级实验室(ABSL-2)中进行实验。实验动物的使用严格遵循3R原则,本实验得到了中国医学科学院医学实验动物研究所动物使用和管理委员会的批准。 模型建立 取100 μL病毒液(8×106 Copies/μL),尾静脉接种4-6周Stat1-/-小鼠。每日称重,观察。采取感染后第2、4、6、8天小鼠全血,分离血清检测病毒载量;分批安乐小鼠,采取肝脏、脑、生殖器等器官,用于病毒载量检测及组织病理学观察。

CSTR:16397.09.0H01001445 TSPO KO-APP/PS1小鼠模型 TSPO KO-APPswe/PSEN1dE9(APP/PS1)mice model

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是最常见的因脑部退行性病变而引起进行性痴呆症的神经退行性疾病,逐渐成为严重影响老年人健康的疾病之一。AD的临床症状包括进行性记忆减退、行动能力受损和日常活动困难;AD的早期症状为思维和行为无意识的改变、对新信息的记忆障碍以及语言的功能障碍性改变;AD的主要病理特征包括脑组织中Aβ斑块沉积和细胞内神经原纤维缠结,其次还有胶质细胞活化和神经元死亡,并伴有炎症和突触改变等病理发生。越来越多的证据证明神经炎症在AD的发生发展中发挥着重要的作用。 目前尚无有效的治疗AD的方法,可能因为缺乏明确的致病机制。过去的几十年研究为 Aβ和Tau蛋白的中心作用以及胶质细胞在AD发病机制中的各种分子和细胞途径中的作用提供了越来越多的证据。AD的发病机制包括多种成分的致病作用和中枢神经系统内各种细胞类型的行为改变。尽管已获得了AD的很多相关理论知识,但是还没有成功开发出有效的治AD的策略。与Aβ沉积相比,Tau蛋白在脑组织中的积累被认为发生的较晚,但AD患者的认知能力下降的关系更密切。基于淀粉样蛋白和Tau蛋白病理学的暂时出现以及Aβ过量产生导致AD的证据,同时越来越多的证据表明神经炎症在AD的发病机制中也起着十分重要的作用。

实验材料 1.1 实验动物 TSPO KO小鼠由本实验构建及繁殖。AD模型小鼠 APPswe/PSEN1dE9(APP/PS1)小鼠来源于 Jackson Laboratory。 1.2 主要实验仪器 PCR核酸扩增仪(Veriti FAST,Applied Biosystems) 激光共聚焦荧光显微镜(LSM780,Zeiss) 倒置荧光显微镜(DMi8,Leica) 酶标仪 (MULTISKAN FC, Thermo Fisher Scientific) DYY-6C 蛋白电泳仪(六一仪器厂) 凝胶图像分析仪 InGenius (SYNGENE) 台式低温离心机(Heraeus Biofuge Primo R,Thermo Fisher Scientific) 二氧化碳细胞培养箱(Heracell 240i, Thermo Fisher Scientific) 生物安全柜(Herasafe, Thermo Fisher Scientific) 2. 实验操作规程和动物处理伦理 实验动物培养在中国医学科学院基础医学研究所 SPF 级实验动物中心屏障设施内繁殖及饲养。研究中所使用的小鼠实验方法均由中国医学科学院基础医学研究所实验动物管理及伦理委员会审查。 2.1 小鼠合笼繁殖: 将TSPO全身敲除小鼠 与APP/PS1双转基因小鼠结合,使用新生约7日的小鼠进行基因型鉴定,得到 TSPO KO-APP/PS1 小鼠及其同窝对照 TSPO WT-APP/PS1小鼠。 2.2 基因型鉴定 使用TSPO 鉴定引物为 HW007、HW008 和 HW009;APP基因型鉴定引物为 OMIR3610、OMIR3611、OMIR7338和OMIR7339;PSEN1基因型鉴定引物为OMIR1644、OMIR1645、 OMIR7338 和 OMIR7339进行PCR鉴定基因型。引物序列为: 引物HW007 5’ GATGGAGAAACTGAGTCCCAGTCAGGG -3’ 引物HW008 5’ GCTCTGCCCTAATCACAAAGTTTCACAC -3’  引物HW009 5’ TTAAGGAGAGGTTTTGTCCTTGTGTC -3’ 引物OMIR3610 5’ AGGACTGACCACTCGACCAG -3’ 引物OMIR3611 5’ CGGGGGTCTAGTTCTGCAT -3’ 引物OMIR7338 5’ CTAGGCCACAGAATTGAAAGATCT -3’ 引物OMIR7339 5’ GTAGGTGGAAATTCTAGCATCATCC -3’ 引物OMIR1644 5’ AATAGAGAACGGCAGGAGCA -3’ 引物OMIR1645 5’ GCCATGAGGGCACTAATCAT -3’

Zhang H, Wang H, Gao F, Yang J, Xu Y, Fu Y, Cai M, Zhang X, Yang Q, Tong K, Hu Y, Chen H, Ma C, He W, Zhang J. TSPO deficiency accelerates amyloid pathology and neuroinflammation by impairing microglial phagocytosis. Neurobiol Aging. 2021 Oct;106:292-303. doi: 10.1016/j.neurobiolaging.2021.06.020. Epub 2021 Jul 3. PMID: 34340010.

CSTR:16397.09.0G01001444 TSPO过表达小鼠模型 TSPO Tg mice model

为了更好研究 TSPO 的功能以及其在炎症发生发展中的作用,采用 ROSA26 定点插入条件性基因过表达的方法,构建TSPO 过表达小鼠。 将 ROSA26 定点插入 TSPO 基因,得到的 TSPO Tg floxed/+ 小鼠。与本室原有的 在精子中特异性表达Cre酶的pCre+转基因阳性小鼠进行交配,可得到 TSPO Tg floxed/+,pCre+小鼠,该基因型的雄性小鼠即有部分精子带有 TSPO 过表达基因;然后选取该基因型的雄性小鼠与 8 周 龄雌性小鼠进行第二轮交配,可得到 TSPO 全身过表达小鼠 TSPO Tg 和其通窝对照 WT 小鼠。杂交策略图如图所示。

Zhang X*, Han J*, Xu Y, Gao F, Han J, Chen H, He W*, Zhang J*. TSPO Deficiency Exacerbates GSDMD-mediated Macrophage Pyroptosis in Inflammatory Bowel Disease.  Cells. 2022 Mar 2;11(5):856. doi: 10.3390/cells11050856. PMID: 35269479; PMCID: PMC8909696.

CSTR:16397.09.0G01001443 TSPO敲除/条件性基因敲除小鼠模型 TSPO KO/cKO mice model

虽然TSPO在炎症,尤其是神经炎症性疾病中发挥重要作用已经被广泛证实,但是其具体作用尚未明确,对其相互作用蛋白及在信号通路中所处的位置也研究甚少,这与缺乏有效的模型有密切关系。为了进一步研究TSPO在炎症反应中的功能,本研究构建了TSPO基因敲除和条件性基因敲除小鼠。

小鼠的TSPO基因定位在第15条染色体上,由四个外显子(Exon)组成,外显子Exon 2和Exon 3距离较近,用于设计Floxed载体。将筛选序列(Neo)插在Exon 3和Exon 4之间,Neo基因两端使用Flp-Frt系统,在获得杂合子小鼠后可以与Flp转基因小鼠进行交配,切除Neo筛选基因。两个Loxp位点分别位于Exon 2上游及Frt下游,切除掉Frt-Neo片段后,Loxp将位于Exon 3下游,得到最终的Floxed同源染色体。  

Zhang H#, Wang H#, Gao F#, Yang J, Xu Y, Fu Y, Cai M, Zhang X, Yang Q, Tong K, Hu Y, Chen H, Ma C, He W*, Zhang J*. TSPO deficiency accelerates amyloid pathology and neuroinflammation by impairing microglial phagocytosis. Neurobiol Aging. 2021 Oct;106:292-303. doi: 10.1016/j.neurobiolaging.2021.06.020. Epub 2021 Jul 3. PMID: 34340010.

CSTR:16397.09.0C16001442 新冠变异株Delta感染恒河猴模型 SARS-CoV-2 Delta strain infected Rhesus macaques model

新型冠状病毒肺炎(Corona Virus Disease 2019,COVID-19),简称“新冠肺炎”,是新型冠状病毒(SARS-CoV-2)感染引起的急性呼吸道传染病,可导致急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome, ARDS)、感染性休克、多器官的衰竭,甚至死亡。新冠疫情的爆发给全球人民的健康及经济发展都带来了巨大的威胁,被世界卫生组织定义为“国际关注的突发公共卫生事件”。随着SARS-CoV-2在全球的流行,产生了很多变异株,世界卫生组织(WHO)建立了遗传变异分类系统,将新冠病毒的变异株分成了两类,分别是“关切变异株”(Variants of Concern,VOCs)和需关注的变异株(Variants of Interest,VOIs) 。VOCs 意味着病毒已传染至多国,传染性和严重程度已经被证实或疑似存在显著影响。WHO 将 Alpha (B.1.1.7)、Beta (B.1.351)、Gamma (P.1)、Delta(B.1.617.2)和 Omicron(B.1.1.529)变异株定义为 VOCs。 最早在 2020 年 10 月于印度发现 Delta 变异株(B.1.617.2)。其 S 蛋白关键突变位点有 T478K、L452R 、D614G 和 P681R 等。其中 681 位氨基酸突变也在 Alpha 变异株中发现,681 氨基酸残基位于 S 蛋白 Furin 酶切位点附近,P681R取代提高了S1-S2切割效率,增加了病毒对宿主细胞的吸附及融合的能力,从而导致传播率增加65%。感染Delta的患者病情更严重,死亡率更高,已被证明P681R突变是导致Delta变异株致病力增加的原因。Delta传染性比以往任何新冠变异毒株都高,比 Alpha 高 50%,同时也是原始新冠病毒的两倍。

实验材料 1.1  SARS-CoV-2(Delta毒株),由中国医学科学院医学实验动物研究所提供。 1.2 实验动物 选用SPF级1-3岁恒河猴,2.5-3.5kg,来自中国医学科学院医学实验动物研究所(IACUC 批准号:DW21007) 1.3实验环境 所有涉及的病毒实验操作全部在中国医学科学院医学实验动物研究所ABSL-3实验室完成,该实验室已经具备相关实验室和福利伦理资质。 1.4病原培养鉴定 将新型冠状病毒接种到Vero细胞进行分离和储存。Vero细胞培养在DMEM(英潍捷基, 美国)添加10%胎牛血清,100 IU/ml 青霉素和100 μg/ml链霉素的培养基中,环境为37°C,5%CO2。新型冠状病毒的病毒滴度用标准的半数细胞感染率(a standard 50% tissue culture infection dose,TCID50)进行分析。 1.5实验操作规程 (1) 感染途径:经气管感染; (2) 感染剂量:1×106 TCID50 只; (3) 感染体积:1ml/只; (4) 对照组:等体积 PBS。 1.6 动物模型分析 (1)症状观察:感染后,每天观察动物一般症状,记录体重和体温等。 (2)病毒载量:定时收集各组动物脏器,进行RNA抽提,利用RT-PCR技术,检测组织中病毒载量。RT-PCR所用的新型冠状病毒引物如下:上游为5’-TCGTTTCGGAAGAGACAGGT-3’ 下游为5’-GCGCAGTAAGGATGGCTAGT-3’。 (3)病毒分离:肺组织在 DMEM 溶液中研磨制备成匀浆,离心分离上清后,接种于Vero细胞分离病毒并观察细胞病变。 (4)病理学观察 用新鲜的组织福尔马林固定,制备石蜡切片,用HE,免疫组化或荧光染色,镜下观察。 (5)免疫学检测:感染前、感染后收集外周血、淋巴结检测适应性免疫细胞的表达情况,以及血清中特异性抗体。 1.7数据统计处理方法 所有的数据用GraphPad Prism 6.0 软件分析,感染组小鼠和其他对照组小鼠用T 检验方法分析差异,显著性差异用*p ﹤ 0.05, **p﹤0.01 或者 #p﹤0.05, ##p﹤0.01 

Deng W, Lv Q, Li F, Liu J, Song Z, Qi F, Wei Q, Yu P, Liu M, Zhou S, Zhang Y, Gao H, Wang N, Jia Z, Gao K, Liu J, Xiao C, Shang H, Wang X, Bao L, Qin C. Sequential immunizations confer cross-protection against variants of SARS-CoV-2, including Omicron in Rhesus macaques. Signal Transduct Target Ther. 2022 Apr 18;7(1):124. doi: 10.1038/s41392-022-00979-z. PMID: 35436986; PMCID: PMC9014776.

CSTR:16397.09.0C16001441 新冠变异株Omicron感染恒河猴模型 SARS-CoV-2 Omicron strain infected Rhesus macaques model

新型冠状病毒肺炎(Corona Virus Disease 2019,COVID-19),简称“新冠肺炎”,是新型冠状病毒(SARS-CoV-2)感染引起的急性呼吸道传染病,可导致急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome, ARDS)、感染性休克、多器官的衰竭,甚至死亡。新冠疫情的爆发给全球人民的健康及经济发展都带来了巨大的威胁,被世界卫生组织定义为“国际关注的突发公共卫生事件”。随着SARS-CoV-2在全球的流行,产生了很多变异株,世界卫生组织(WHO)建立了遗传变异分类系统,将新冠病毒的变异株分成了两类,分别是“关切变异株”(Variants of Concern,VOCs)和需关注的变异株(Variants of Interest,VOIs) 。VOCs 意味着病毒已传染至多国,传染性和严重程度已经被证实或疑似存在显著影响。WHO 将 Alpha (B.1.1.7)、Beta (B.1.351)、Gamma (P.1)、Delta(B.1.617.2)和 Omicron(B.1.1.529)变异株定义为 VOCs。 Omicron变异株是 COVID-19 大流行期间 SARS-CoV-2 变异株中具有最多变异的毒株。奥密克戎变异株的氨基酸突变广泛分布在四种结构蛋白上,包括刺突蛋白(S)、包膜蛋白(E)、膜蛋白(M)、核衣壳蛋白(N)和非结构蛋白(NSPs)(NSP3、NSP4、NSP5、NSP6、NSP12、NSP1)。Omicron变异株刺突蛋白的突变数量是Delta变异株的两倍。其传染性可能比原始病毒高10倍以上,大约是德尔塔病毒的两倍。

实验材料 1.1  SARS-CoV-2(Omicron毒株),由中国医学科学院医学实验动物研究所提供。 1.2 实验动物 选用SPF级1-3岁恒河猴,2.5-3.5kg,来自中国医学科学院医学实验动物研究所(IACUC 批准号:DW21007) 1.3实验环境 所有涉及的病毒实验操作全部在中国医学科学院医学实验动物研究所ABSL-3实验室完成,该实验室已经具备相关实验室和福利伦理资质。 1.4病原培养鉴定 将新型冠状病毒接种到Vero细胞进行分离和储存。Vero细胞培养在DMEM(英潍捷基, 美国)添加10%胎牛血清,100 IU/ml 青霉素和100 μg/ml链霉素的培养基中,环境为37°C,5%CO2。新型冠状病毒的病毒滴度用标准的半数细胞感染率(a standard 50% tissue culture infection dose,TCID50)进行分析。 1.5实验操作规程 (1) 感染途径:经气管感染; (2) 感染剂量:1×106 TCID50 只; (3) 感染体积:1ml/只; (4) 对照组:等体积 PBS。 1.6 动物模型分析 (1)症状观察:感染后,每天观察动物一般症状,记录体重和体温等。 (2)病毒载量:定时收集各组动物脏器,进行RNA抽提,利用RT-PCR技术,检测组织中病毒载量。RT-PCR所用的新型冠状病毒引物如下:上游为5’-TCGTTTCGGAAGAGACAGGT-3’ 下游为5’-GCGCAGTAAGGATGGCTAGT-3’。 (3)病毒分离:肺组织在 DMEM 溶液中研磨制备成匀浆,离心分离上清后,接种于Vero细胞分离病毒并观察细胞病变。 (4)病理学观察 用新鲜的组织福尔马林固定,制备石蜡切片,用HE,免疫组化或荧光染色,镜下观察。 1.7数据统计处理方法 所有的数据用GraphPad Prism 6.0 软件分析,感染组小鼠和其他对照组小鼠用T 检验方法分析差异,显著性差异用*p ﹤ 0.05, **p﹤0.01 或者 #p﹤0.05, ##p﹤0.01

Deng W, Lv Q, Li F, Liu J, Song Z, Qi F, Wei Q, Yu P, Liu M, Zhou S, Zhang Y, Gao H, Wang N, Jia Z, Gao K, Liu J, Xiao C, Shang H, Wang X, Bao L, Qin C. Sequential immunizations confer cross-protection against variants of SARS-CoV-2, including Omicron in Rhesus macaques. Signal Transduct Target Ther. 2022 Apr 18;7(1):124. doi: 10.1038/s41392-022-00979-z. PMID: 35436986; PMCID: PMC9014776.

CSTR:16397.09.0C01001438 Hipp11位点插入过表达人源VLDLR小鼠 C57.H11(tm-CAG-VLDLR)-GC/ILAS

科萨其病毒、鼻病毒、人呼吸道合胞病毒可能与SARS-COV2合并感染加重症状并导致是高致死率。人呼吸道合胞病毒、鼻病毒等不但在我国的儿童和老年人中有一定的流行,而且是易突变的RNA病毒。而这几种呼吸道病毒目前没有实用的动物模型。建立这些呼吸道病毒的动物模型,不仅可以研究SARS-cov2合并感染的致病机制和优化治疗方案、也可为人呼吸道合胞病毒、鼻病毒的防治提供模型。 更重要的是可为这类病毒突变引起的未来威胁提供前瞻性模型储备。

利用CRISPR/Cas9的方法构建基因敲入小鼠。

CSTR:16397.09.0C01001437 Hipp11位点插入过表达人源ATP1A1小鼠 C57.H11(tm-CAG-ATP1A1)-GC/ILAS

科萨其病毒、鼻病毒、人呼吸道合胞病毒可能与SARS-COV2合并感染加重症状并导致是高致死率。人呼吸道合胞病毒、鼻病毒等不但在我国的儿童和老年人中有一定的流行,而且是易突变的RNA病毒。而这几种呼吸道病毒目前没有实用的动物模型。建立这些呼吸道病毒的动物模型,不仅可以研究SARS-cov2合并感染的致病机制和优化治疗方案、也可为人呼吸道合胞病毒、鼻病毒的防治提供模型。 更重要的是可为这类病毒突变引起的未来威胁提供前瞻性模型储备。

利用CRISPR/Cas9的方法构建基因敲入小鼠。

CSTR:16397.09.0C01001436 Hipp11位点插入过表达人源ICAM1小鼠 C57.H11(tm-CAG- ICAM1)-GC/ILAS

科萨其病毒、鼻病毒、人呼吸道合胞病毒可能与SARS-COV2合并感染加重症状并导致是高致死率。人呼吸道合胞病毒、鼻病毒等不但在我国的儿童和老年人中有一定的流行,而且是易突变的RNA病毒。而这几种呼吸道病毒目前没有实用的动物模型。建立这些呼吸道病毒的动物模型,不仅可以研究SARS-cov2合并感染的致病机制和优化治疗方案、也可为人呼吸道合胞病毒、鼻病毒的防治提供模型。 更重要的是可为这类病毒突变引起的未来威胁提供前瞻性模型储备。

利用CRISPR/Cas9的方法构建基因敲入小鼠。

CSTR:16397.09.0C01001435 Hipp11位点插入过表达人源CDHR3小鼠 C57.H11(tm-CAG-CDHR3)-GC/ILAS

科萨其病毒、鼻病毒、人呼吸道合胞病毒可能与SARS-COV2合并感染加重症状并导致是高致死率。人呼吸道合胞病毒、鼻病毒等不但在我国的儿童和老年人中有一定的流行,而且是易突变的RNA病毒。而这几种呼吸道病毒目前没有实用的动物模型。建立这些呼吸道病毒的动物模型,不仅可以研究SARS-cov2合并感染的致病机制和优化治疗方案、也可为人呼吸道合胞病毒、鼻病毒的防治提供模型。 更重要的是可为这类病毒突变引起的未来威胁提供前瞻性模型储备。

利用CRISPR/Cas9的方法构建基因敲入小鼠。

CSTR:16397.09.0C01001434 Hipp11位点插入过表达人源CA9小鼠 C57.H11(tm-CAG- CA9)-GC/ILAS

科萨其病毒、鼻病毒、人呼吸道合胞病毒可能与SARS-COV2合并感染加重症状并导致是高致死率。人呼吸道合胞病毒、鼻病毒等不但在我国的儿童和老年人中有一定的流行,而且是易突变的RNA病毒。而这几种呼吸道病毒目前没有实用的动物模型。建立这些呼吸道病毒的动物模型,不仅可以研究SARS-cov2合并感染的致病机制和优化治疗方案、也可为人呼吸道合胞病毒、鼻病毒的防治提供模型。 更重要的是可为这类病毒突变引起的未来威胁提供前瞻性模型储备。

利用CRISPR/Cas9的方法构建基因敲入小鼠。