SD大鼠

在本实验中，我们利用Trim44flox/flox大鼠和NeuN-Cre大鼠进行杂交，繁育得到Trim44flox/flox-NeuN-Cre大鼠。Trim44flox/flox大鼠是在Trim44基因第1外显子的两端插入flox序列，因此当与NeuN-Cre大鼠杂交后，神经元中的Cre酶会特异性剪切Trim44基因的第1外显子，导致Trim44基因的特异性敲除。

提取2M龄野生型大鼠心、肝、脾、肺、肾、脑、胸腺、淋巴结和肌肉组织总蛋白，Western blot比较TRIM44蛋白在各个脏器或者组织中的表达。如图1结果显示，TRIM44在脑、胸腺和淋巴结中表达最高，在脾和肺中表达较高，在肝和肾中表达较低，而心和肌肉中表达最低。

为了验证特异性敲除模型构建成功，我们分别提取2M龄野生型和敲除大鼠大脑、小脑和延脑组织总蛋白，Western blot鉴定TRIM44蛋白在脑组织中的敲除表达。如图2结果显示，TRIM44Trim44在大脑、小脑和延脑的敲除效率分别为66.8%、59.9%和46.6%。免疫组化结果提示TRIM44敲除大鼠大脑皮层中表达减少。说明特异性敲除大鼠模型建立成功。

注：A： Western blot检测大鼠心、肝、脾、肺、肾、脑、胸腺、淋巴结和肌肉组织中TRIM44的表达；B：Trim44蛋白表达的相对量化比较。

图1 TRIM44组织表达谱

注：A：Trim44脑特异敲除大鼠的繁育策略；B：Western blot鉴定TRIM44在敲除大鼠脑组织中的表达；C，：TRIM44表达定量分析，GAPDH作为内参校正；D，：IHC分析TRIM44在脑皮层的表达。与野生对照组相比，*P<0.05。

图2 TRIM44蛋白在敲除大鼠脑组织的表达鉴定

敲除大鼠和同窝对照大鼠分别在7月龄、12月龄进行水迷宫和Y迷宫测试。7月龄时，在5天的游泳学习中，敲除大鼠的潜伏期和野生型相比，差异不显著。在第六天第6天的空间探索实验中，敲除大鼠跨台次数减少，但不具统计学意义。Y迷宫中，7月龄敲除大鼠和野生对照相比，自发交替率和在新异臂中运动距离百分比均没有显著差异。12月龄时，在5天的游泳学习训练中，第1天、第4天和第5天敲除大鼠的潜伏期和野生型相比，显著增加；空间探索实验中，敲除大鼠跨台次数显著减少。Y迷宫中，12月龄敲除大鼠和野生对照相比，自发交替率差异不显著，但在新异臂中运动距离百分比显著下降。同时，12月龄敲除大鼠和同窝对照大鼠进行了48 h食物迷宫测试，结果显示，敲除大鼠找到食物的潜伏期显著增加，与水迷宫结果一致, 提示12月龄敲除大鼠学习记忆能力下降。

注：A, E： 7月龄和12月龄Trim44脑特异敲除大鼠的水迷宫测试5天 d训练期中潜伏期变化折线图；B, F： 7月龄和12月龄Trim44脑特异敲除大鼠第6天空间探索；C，G：7月龄和12月龄Trim44脑特异敲除大鼠Y迷宫中自发交替率；D，H 7月龄和12月龄Trim44脑特异敲除大鼠Y迷宫新异臂中运动距离百分比。I-~K,12月龄Trim44脑特异敲除大鼠食物迷宫中潜伏期升高。7月龄所有行为实验中，WT大鼠（n=25），Trim44-cko大鼠（n=10）；12月龄水迷宫中，WT大鼠（n=20），Trim44-cko大鼠（n=12）；12月龄Y迷宫及新异臂，WT大鼠（n=20），Trim44-cko大鼠（n=18）；食物迷宫（n=15）每组。与野生对照组相比，*P<0.05。*，p <0.05; **，p <0.01; ns，无显著性。

图3 Trim44基因敲除大鼠学习记忆能力测试

12月龄敲除大鼠和同窝对照大鼠在行为学结束后，取脑固定，石蜡切片后行TUNEL染色。结果表明，敲除大鼠脑皮层及海马区神经元发生零星小面积凋亡，并随月龄有所增加。提取12月龄野生型和敲除大鼠大脑组织总蛋白，Western blot检测caspase蛋白在脑组织中的表达,与对照大鼠相比，敲除大鼠脑组织中活性形式的caspase 3、caspase 9蛋白表达分别增加87.3%和38.5%，且具有统计学意义。因此，Trim44敲除导致神经元凋亡且caspase相关蛋白表达增加。

注：A：12月龄野生和敲除大鼠脑切片TUNEL染色（n=7）；B： TUNEL阳性细胞定量分析；C：Western blot鉴定cleaved-caspase3和cleaved-caspase9在敲除大鼠脑组织中的表达（n=3）；D：cleaved-caspase3和cleaved-caspase9蛋白表达定量分析，GAPDH作为内参校正。与野生对照组相比，*P<0.05。

图4 Trim44基因敲除大鼠大脑切片TUNEL染色和caspase蛋白表达检测

1 动物模型基因型鉴定

Trim44-flox的基因型检测采用引物5′-ACTTTTCCTCTGCCCCACTAGATC-3′和引物5′-CCACTTTACCCACGCCGTC-3′进行PCR鉴定。NeuN-cre的基因型鉴定采用引物5′CCTCTCAGATGTTGGAACTCTCT-3′和 5′-GTGCCTTCTCTACACCTGCG-3′进行PCR鉴定。Trim44flox/flox 纯合子和Cre 阳性动物为敲除大鼠。

2 WB和IHC评价该基因在敲除大鼠的蛋白表达水平

提取子代大鼠大脑组织总蛋白，进行免疫印迹，确认Trim44在脑组织蛋白中表达缺失。

3 生存率情况

 敲除大鼠存活和生育能力正常。

4 行为学评价

采用Y迷宫测试大鼠的短时记忆，水迷宫和食物迷宫测试大鼠的空间学习记忆。7月龄大鼠认知下降不明显，12月龄大鼠无论Y迷宫还是水迷宫和食物迷宫测试均可见显著学习记忆能力显著下降。