肠道病毒EV71腹腔注射感染PTX31基因敲除小鼠模型-

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资源中文名称

肠道病毒EV71腹腔注射感染PTX31基因敲除小鼠模型

资源英文名称

Enterovirus EV71 intraperitoneally infected PTX31 knockout mouse model

疾病概述

手足口病( hand, foot and mouth disease，HFMD)是由多种肠道病毒引发的病毒性传染病，主要传播途径是粪口传播，多发于婴幼儿以及5岁以下儿童。手足口病一般为自限性的，轻症表现为发热和手、足、口腔等部位出现疱疹或斑丘疹，多数患儿一周左右自愈；但少数患儿可引起心肌炎、肺水肿、无菌性脑膜脑炎等重症的神经系统并发症。个别重症患儿病情发展快，可导致死亡。手足口病在我国2008年开始暴发流行，当年累计病例489540例，死亡127例；其后发病病例呈逐年上升趋势， 2014年至2016年累计7302354例病例。在人群方面，手足口病高发于5岁以下婴幼儿，其中以1~3岁发病率最高，各个年龄段罹患率、重症率、死亡率男性均高于女性，人口密度越大发病率越高。在时间方面，手足口病爆发存在明显季节性特征，尽管全年均有手足口病感染情况，但主要高发于夏季， 4~6月达发病高峰。地区差别、气温、相对湿度、降水、日照时数、气压等气象因素也在该病的传播中起重要作用。自2008年5月2日，手足口病已被我国列为丙类传染病，该病流行已成为严重的公共卫生问题，为我国带来了巨大的经济和健康负担。引发手足口病的肠道病毒有20多种（型），主要由肠道病毒（enterovirus）、柯萨奇病毒（coxsakievirus）和埃可病毒（echovirus）组成。这些病原均属于小RNA病毒科肠道病毒属（Enterovirus genus），基本结构为无包膜的二十面体，其直径为20-30nm，由核酸和蛋白质组成，是单股正链RNA病毒。病毒基因组含有两个非编码区和一个开放阅读框，开放阅读框编码多聚蛋白；其中VP1基因序列具有高度多样性，且较为稳定，因此可作为肠道病毒属血清型分型依据和评价疫苗效价的生物标志物。手足口病毒主要通过粪口途径传播，经胃肠道进入机体内。 EV71作为手足口病的主要病原，于1969年首次在加利福尼亚神经异常的病人体内分离并鉴定。最近几十年，EV71感染引起的手足口病疫情在世界范围内大爆发，主要集中于亚太地区。我国自2008年开始发生手足口病流行以来，EV71一直是主要的流行病原，且该病毒感染伴随严重的并发症几率相对较高，包括脑干脑炎、无菌性脑膜炎、肺水肿或肺出血、急性弛缓性麻痹和心力衰竭；因此一直是手足口病研究的重点。 PTX3是体液性天然免疫系统的一种可溶性模式识别受体，被称为“抗体前体”，可识别外源微生物，作为调理素调节炎症反应。PTX3由吞噬细胞产生，由中性粒细胞储存，经刺激后产生释放可与部分抗原结合，被巨噬细胞或中性粒细胞相应受体识别，从而增强其吞噬活性，促进机体天然免疫。PTX3对外界感染导致的免疫系统产生的炎症反应具有调控作用：一方面PTX3通过调节补体功能来进行相关调节，它可以识别多种补体成分，从而激活补体系统，同时它也对补体激活又具有负调控作用。另一方面，PTX3还通过调控炎性细胞的募集来参与炎症反应；该效应由PTX3与粘附分子P-选择素（P-selectin）的相互作用来介导，二者结合可减少炎症部位对中性粒细胞募集，抑制白细胞滚动进而抑制炎性细胞浸润。PTX3在病毒性感染引发的炎症中起着重要的作用。

实验动物背景信息

PTX3基因敲除小鼠（PTXF3^-/-C57BL/6N）

模型制作方法

1.实验材料

1.1 实验动物

PTX3基因敲除小鼠（PTX3^-/- C57BL/6N）购于百奥赛图基因生物技术有限公司，通过PCR鉴定基因敲除小鼠是否为纯合子；基因敲除小鼠在医学实验动物研究所屏障设施动物房中繁殖饲养。SPF级10日龄野生型C57BL/6N小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司和北京华阜康生物科技股份有限公司。感染用动物由母鼠自然哺乳，在ABSL-2实验室独立饲养。

1.2 主要实验仪器

Olympus光学显微镜

Thermo二氧化碳培养箱

Sigma低温高速离心机

海尔-20℃冰箱

SANYO -80℃超低温冰箱

ABI QuantStudio^TM 3荧光定量PCR仪

哈东联生物安全柜（型号：HDL）

高压灭菌锅（TOMY SX-700）

Eppendorf 离心机

Eppendorf 移液器

2. 实验操作规程和动物处理伦理

模型制作中涉及动物的操作程序已获得中国医学科学院医学实验动物研究所实验动物使用与管理委员会的批准，批准号为LJN21002，简要步骤如下：

2.1 PTX3基因敲除小鼠的鉴定：

采用的检测引物为：

Primer	Sequence (5’-3’)
Ptx3-WT-F	GCGCTAGCACTTCAGGTTACAGCAA
Ptx3-WT-R	AGCTTGCTTCATTGGCTATCTATGTT
Ptx3-Mut-F	GCGCTAGCACTTCAGGTTACAGCAA
Ptx3-Mut-R	AAGCTTTGTGTGGCAATGTCGAGAG

2.2 病毒准备：

EV71病毒为FY0805毒株经小鼠传代所获得的适应株MP10（GenBank accession number:HQ712020）。组织病毒培养操作：

将EV71病毒以肌肉点注方式感染10日龄ICR乳鼠，三天后取肌肉组织置于适量PBS中研磨均匀，3000rpm离心30min，上清即为病毒液，分装后置于-80℃冰箱保存。

2.3 病毒感染：

根据预实验确定的感染剂量，即病毒滴度为10⁵TCID₅₀/mL的EV71病毒，将病毒经腹腔注射感染小鼠，感染剂量为100μl。感染小鼠包括：野生型C57BL/6N小鼠、纯合子PTX3^-/-C57BL/6N小鼠。

模型表型数据

1. 临床症状表型：

为了研究PTX3在EV71病毒感染引发的炎症反应中的作用，我们采用C57小鼠与PTX3^-/-小鼠腹腔注射100 μl EV71病毒，观察记录体重、临床评分及生存率。与C57小鼠相比，PTX3^-/-小鼠临床评分上升更快，在感染后第4天达到3分，第5天达到4分以上（图1A）；C57小鼠于感染后第11天全部死亡，而PTX3^-/-小鼠于感染后第8天全部死亡（图1B）；体重两组小鼠均为先上升再下降（图1C）；自感染后0天开始，用腹腔注射PTX3蛋白治疗C57小鼠（200 μg/kg），结果导致小鼠死亡率大幅降低，抑制体重下降，PTX3蛋白治疗PTX3^-/-（400 μg/kg）小鼠延缓了死亡时间，于感染后第12天全部死亡。该结果提示PTX3缺乏使EV71感染症状加重，PTX3蛋白治疗可使EV71感染症状减轻。

图1. EV71感染PTX3^-/-小鼠的临床指标观察

2. 血液和组织中EV71病毒复制情况：

选取10日龄，体重4-6 g的C57小鼠和PTX3^-/-小鼠分别经腹腔注射100 μl EV71病毒，C57小鼠治疗组自感染0天起每日腹腔注射200 μg/kg PTX3蛋白，PTX3^-/-小鼠治疗组自感染0天起每日腹腔注射400 μg/kg PTX3蛋白。分别于感染后第3、5和7天对血液和肌肉组织进行取材，荧光实时定量法检测病毒载量。如图2所示，C57小鼠血液与肌肉中病毒载量均表现为先上升后下降的趋势，而PTX3^-/-小鼠在感染后第3、5和7天时病毒载量均处于较高水平。在感染后第3和5天C57小鼠与PTX3^-/-小鼠血液中病毒载量无显著性差异，在感染后第7天C57小鼠病毒载量下降至1.9×10⁵copies/μl，而PTX3^-/-仍较高为4.88×10⁶copies/μl，且两组存在显著性差异；在病毒感染后第3和7天PTX3^-/-小鼠肌肉中病毒载量均高于C57小鼠，而在感染后第5天无显著性差异。该结果提示PTX3缺乏导致EV71在小鼠体内迅速扩增，且不易被机体免疫系统清除。

C57治疗组小鼠血液中病毒载量在感染后第3天最高，为2.75×10⁴ copies/μg，随后降低且均持续处于较低水平；PTX3^-/-治疗组小鼠在感染后第5天病毒载量与C57小鼠治疗组无显著性差异，且显著低于PTX3^-/-未治疗组小鼠。C57治疗组小鼠病毒载量与未治疗组均存在显著性差异，治疗组小鼠在感染后第五天肌肉中病毒载量显著低于未治疗组。该结果提示PTX3蛋白可抑制小鼠体内EV71病毒复制。

图2. PTX3缺乏导致EV71病毒复制增加

3. 病理变化情况：

上述实验发现病毒感染后小鼠临床症状表现为后肢瘫痪，为了观察病变部位的病理损伤，C57组和PTX3^-/-组小鼠腹分别在感染后第3、5和7天后取材后肢骨骼肌制作病理切片进行H&E染色。结果发现各组小鼠的肌肉表现均为骨骼肌细胞坏死和炎性细胞浸润，且病理症状随感染后时间增长而更加严重。相比于C57小鼠（图3 A, B和C），PTX3^-/-小鼠（图3 D, E和F）病理损伤严重，表现出更广泛的骨骼肌坏死及炎性细胞浸润。该结果提示PTX3缺乏导致炎症反应加重，这可能是导致EV71病毒感染加重的原因之一。

图3. PTX3^-/- C57BL/6N小鼠感染EV71病毒骨骼肌组织病理变化情况

动物模型的评价与验证

1. 临床症状观察：

在动物在感染手足口病毒后，其症状与临床病人症状并不一致，在手足口病小鼠模型的临床症状常表现为活动减少、竖毛、弓背、肢体瘫痪和死亡，属于部分疾病模型。参考其他手足口病原感染模型以及文献报道，动物感染EV71病毒后观察13天，每天记录体重变化、症状和死亡率。根据症状严重程度，参照以下标准对动物进行临床评分打分：

0分：未见异常；1分：驼背或炸毛；2分：后肢迟缓无力；3分：单后肢瘫痪；4分：双后肢瘫痪；5分：死亡。

根据临床评分标准，在观察期（12天）内，C57野生型小鼠和PTX3基因敲除小鼠在第4天都可观察到临床症状，且症状持续加重、评分持续升高；PTX3^-/-第5天出现死亡，第8天全部死亡；而野生型C57动物在第6天出现死亡，第11天全部死亡。在PTX3基因敲除小鼠中用PTX3蛋白治疗，可延缓动物的死亡时间，第12天全部死亡；而在野生型C57中使用PTX3蛋白治疗，在观察期内可将死亡率降低到30%。

2. EV71病毒载量测定方法：采用实时荧光定量PCR技术-标准曲线法。

采用的特异性引物：

TEV-A71 -F （5’-GCAGCCCAAAAGAACTTCACT-3’）

TEV-A71 -R （5’-ATCTGCCACCCTATCTCCCT-3’）

TEV-A71-TaqProbe （FAM-TGCAAGGATGCTAGTGATATCCTGC-TAM）

动物在腹腔感染EV71病毒后，C57小鼠血液与肌肉中病毒载量均表现为先上升后下降的趋势，而PTX3^-/-小鼠在感染后第3、5和7天时病毒载量均处于较高水平，表明PTX3缺乏导致EV71在小鼠体内迅速扩增，且不易被机体免疫系统清除。用PTX3蛋白治疗后， C57治疗组和PTX3^-/-治疗组小鼠的病毒载量与未治疗组均存在显著性差异，治疗组小鼠在感染后第五天肌肉中病毒载量显著低于未治疗组。该结果提示PTX3蛋白可抑制小鼠体内EV71病毒复制。

3.病理分析：HE染色

苏木精—伊红染色法（hematoxylin-eosin staining，H&E）是石蜡切片中常用的染色方法：其中苏木精染液呈碱性，可将嗜碱性的细胞核及细胞内核糖体染成蓝紫色；伊红染液呈酸性，将嗜酸性的细胞质及细胞外基质染成红色。

结果发现感染EV71病毒各组小鼠的肌肉表现均为骨骼肌细胞坏死和炎性细胞浸润，且病理症状随感染后时间增长而更加严重。相比于C57小鼠，PTX3^-/-小鼠病理损伤更为严重，表现出更广泛的骨骼肌坏死及炎性细胞浸润。

保存方式

活体

合作方式

不限定

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