| 标识符 | CSTR:16397.09.0B01001453 |
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| 资源中文名称 | 手足口病柯萨奇病毒A16型灌胃感染小鼠模型 |
| 资源英文名称 | Coxsackievirus A16 intragastrically infected mice model |
| 疾病概述 | 手足口病( hand, foot and mouth disease，HFMD)是由多种肠道病毒引发的病毒性传染病，主要传播途径是粪口传播，多发于婴幼儿以及5岁以下儿童。手足口病一般为自限性的，轻症表现为发热和手、足、口腔等部位出现疱疹或斑丘疹，多数患儿一周左右自愈；但少数患儿可引起心肌炎、肺水肿、无菌性脑膜脑炎等重症的神经系统并发症。个别重症患儿病情发展快，可导致死亡。手足口病于1957年在新西兰被发现并以其临床症状而命名，在世界范围内均有流行。在我国2008年开始暴发流行，当年累计病例489540例，死亡127例；其后发病病例呈逐年上升趋势， 2014年至2016年累计7302354例病例。在人群方面，手足口病高发于5岁以下婴幼儿，其中以1~3岁发病率最高，各个年龄段罹患率、重症率、死亡率男性均高于女性，人口密度越大发病率越高。在时间方面，手足口病爆发存在明显季节性特征，尽管全年均有手足口病感染情况，但主要高发于夏季， 4~6月为发病高峰。在地区方面，中国南方一年中存在五月和十月两个发病高峰；而在北方仅有六月一个发病高峰，随着纬度的增加，其半年周期性可能会增强。与此同时，气温、相对湿度、降水、日照时数、气压等气象因素也在该病的传播中起重要作用。自2008年5月2日，手足口病已被我国列为丙类传染病，该病流行已成为严重的公共卫生问题，为我国带来了巨大的经济和健康负担。 引发手足口病的肠道病毒有20多种（型），主要由肠道病毒（enterovirus）、柯萨奇病毒（coxsakievirus）和埃可病毒（echovirus）组成。这些病原均属于小RNA病毒科肠道病毒属（Enterovirus genus），基本结构为无包膜的二十面体，其直径为20-30nm，由核酸和蛋白质组成，是单股正链RNA病毒。病毒基因组含有两个非编码区和一个开放阅读框，开放阅读框编码多聚蛋白;其中VP1基因序列具有高度多样性，且较为稳定，因此可作为肠道病毒属血清型分型依据和评价疫苗效价的生物标志物。手足口病毒主要通过粪口途径传播，经胃肠道进入机体内。病毒在入侵的局部上皮细胞中完成增殖，然后病毒侵入局部淋巴组织中继续增殖并释放入血导致第一次病毒血症。病毒随血液传播接触到正常靶细胞。病毒表面的VP1蛋白与靶细胞表面特异性受体结合，完成吸附过程，其基因组RNA进入胞质。之后，病毒以其正链RNA作为模板，合成互补的负链RNA，又以负链RNA为模板合成病毒正链RNA，从而得到大量病毒RNA，进入子代病毒颗粒组装阶段。通过转录、翻译，复制出二代病毒，再次释放入血形成第二次病毒血症并引起临床症状。 由于CA16病毒主要通过粪口传播，在自然感染状态下经胃肠道侵入机体，因此通过灌胃感染途径得到的动物模型更接近于疾病自然发生的状态。课题组在原有CA16小鼠腹腔注射感染模型的基础上，继续研究了通过灌胃方式建立的小鼠感染模型，为研究病毒的感染机制和机体免疫反应提供研究基础，也可用于药物和疫苗开发和验证实验。 |
| 实验动物背景信息 | ICR小鼠 |
| 模型制作方法 | 1. 实验材料 1.1 实验动物 SPF级7日龄ICR小鼠乳鼠，购自北京维通利华实验动物技术有限公司和北京华阜康生物科技股份有限公司，由母鼠自然哺乳，在ABSL-2实验室独立饲养。 1.2 主要实验仪器 Olympus光学显微镜 Thermo二氧化碳培养箱 Sigma低温高速离心机 海尔-20℃冰箱 SANYO -80℃超低温冰箱 ABI QuantStudioTM 3荧光定量PCR仪 哈东联生物安全柜（型号：HDL） 高压灭菌锅（TOMY SX-700） Eppendorf 离心机 Eppendorf 移液器 2. 实验操作规程和动物处理伦理 模型制作中涉及动物的操作程序已获得中国医学科学院医学实验动物研究所实验动物使用与管理委员会的批准，批准号为LJN20013，简要步骤如下： 2.1 病毒准备： CA16病毒（shzh05-1，GenBank: EU262658），2008年分离自深圳市，在人横纹肌瘤细胞（RD）中培养、扩增，并采用反复冻融法释放病毒，离心富集病毒。 2.1.1 细胞病毒培养操作： RD细胞经常规传代培养接种到T75细胞培养瓶，培养至融合度约80%；感染前弃去原培养基，细胞用含2%双抗的PBS 洗2遍，吸出PBS后加入无血清DMEM培养基。接种适量的CA16病毒后，置于37℃ 5% CO2培养箱孵育1~2h；之后弃去无血清培养基，加入完全培养基继续培养。接种病毒后2~3d细胞病变CPE达到+++～++++，将T75细胞瓶置封口袋中，-80℃超低温冰箱冻化3次。然后将培养液转移至50mL离心管中，4℃ 2000rpm离心20min，沉淀细胞碎片。吸取病毒上清，分装后冻存，并测定病毒滴度TCID50。 2.1.2 组织病毒培养操作： 将CA16病毒以肌肉点注方式感染10日龄ICR乳鼠，三天后取肌肉组织置于适量PBS中研磨均匀，3000rpm离心30min，上清即为病毒液，分装后置于-80℃冰箱保存。 2.2 病毒感染： 根据预实验确定的感染剂量，即病毒滴度为108 TCID50/mL的CA16毒株，将病毒经灌胃途径感染小鼠，感染剂量为100μl。对照组灌胃同等量的PBS。 |
| 模型表型数据 | 1. 临床症状表型： 7日龄ICR小鼠灌胃感染CA16病毒5天后，开始出现不同程度的临床症状，症状由轻到重包括：驼背或炸毛，后肢无力，单后肢瘫痪，双后肢瘫痪，严重的直至死亡。临床症状评分持续升高，8dpi感染小鼠出现死亡。到观察期结束（12dpi）时平均临床评分为3分，存活率为60%（图1A，1B）。监测体重情况，发现感染小鼠体重增加未出现显著减缓，与未感染的对照小鼠不存在显著性差异（图1C）。
图1. ICR 7日龄乳鼠灌胃感染CA16病毒后症状观察 2. 血液和组织中病毒复制情况： 分析灌胃途径感染CA16的小鼠血液与组织中病毒载量发现，5dpi血液中病毒载量病毒载量高于3dpi（图2A），103~105 Copies/mg。小鼠中肌肉病毒载量变化与腹腔注射途径感染小鼠趋势相同，病毒载量在5dpi均有提升：由均值106 Copies/mg提升至均值107 Copies/mg（图2B）。在其它组织中，CA16病毒载量明显偏低，未有组织病毒载量超过104 Copies/mg（图2C）。
图2. ICR 7日龄乳鼠灌胃感染CA16病毒后血液和组织中病毒载量情况 3. 病理变化情况： CA16病毒具有明显的嗜肌性，感染小鼠后肢肌肉中的病毒载量最高，且感染后的临床症状也表现为后肢的瘫痪症状，病理结果分析发现：骨骼肌病理损伤严重，具体表现为骨骼肌细胞变性坏死、炎细胞浸润（图3A）。除后肢肌肉外，脑组织局部神经元周五和网状神经毡可见空泡，少数神经元发生固缩现象。其他组织，包括脾、胸腺、心脏、肝脏、肺、肾、小肠组织均未见明显病理损伤。 综上可见，通过灌胃感染途径成功建立了CA16病毒感染小鼠模型，相较于腹腔感染途径其症状相对较轻，可以作为腹腔感染重症模型的补充，用于评价疫苗和药物。
图3. ICR 7日龄乳鼠感染CA16病毒后组织病理变化情况（HE染色） |
| 动物模型的评价与验证 | 1.临床症状观察： 在动物在感染手足口病毒后，其症状与临床病人症状并不一致，在手足口病小鼠模型的临床症状常表现为活动减少、竖毛、弓背、肢体瘫痪和死亡，属于部分疾病模型。参考其他手足口病原感染模型以及文献报道，动物感染CA16病毒后观察12天，每天记录体重变化、症状和死亡率。根据症状严重程度，参照以下标准低动物进行临床评分打分： 0：未见异常；1：驼背或炸毛；2：后肢迟缓无力；3：单后肢瘫痪；4：双后肢瘫痪；5：死亡。根据临床评分标准，在灌胃感染CA16病毒观察期（12天）内，5dpi可观察到临床症状，且症状持续加重、评分持续升高；8dpi出现死亡，在观察期结束时存活率为60%。 2. CA16病毒载量测定方法：实时荧光定量PCR技术-标准曲线法。 采用的特异性引物： CA16-F1 （5’-TAGGGACGCACGTGATCTGGGACTTCG-3’） CA16-R1（5’-GCACCAATGGGAACTACATAGTTAGTTTG-3’） 经灌胃感染CA16病毒后，病毒在动物血液和肌肉中复制水平持续增高，在血液中检测值从均值104 copies/μl升高到均值105copies/μl，在肌肉中从均值106 copies/mg上升到107 copies/mg，说明病毒在血液和肌肉中都发生了扩增，尤其是肌肉中病毒载量明显高于血液，体现出典型的嗜肌性，与临床症状表现相吻合。在其他组织中，病毒载量大部分在检测阈值之上，但低于104 copies/mg。 3.病理分析：HE染色
苏木精—伊红染色法（hematoxylin-eosin staining，H&E）是石蜡切片中常用的染色方法：其中苏木精染液呈碱性，可将嗜碱性的细胞核及细胞内核糖体染成蓝紫色；伊红染液呈酸性，将嗜酸性的细胞质及细胞外基质染成红色。 CA16病毒具有明显的嗜肌性，在病理结果上同样可见骨骼肌病理损伤严重，骨骼肌细胞变性坏死、且出现大量炎症细胞浸润。与后肢肌肉中的病毒载量最高、后肢瘫痪的临床症状相一致。除后肢肌肉外，脑组织局部神经元周五和网状神经毡可见空泡，少数神经元发生固缩现象，说明在小鼠CA16灌胃感染模型中也能出现神经性病变。 |
| 保存方式 | 活体 |
| 合作方式 | 不限定 |
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| 备注 |
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