ICR小鼠

1.实验材料

1.1 实验动物

SPF级7日龄ICR小鼠乳鼠，购自北京维通利华实验动物技术有限公司和北京华阜康生物科技股份有限公司，由母鼠自然哺乳，在ABSL-2实验室独立饲养。

1.2 主要实验仪器

Olympus光学显微镜

Thermo二氧化碳培养箱

Sigma低温高速离心机

海尔-20℃冰箱

SANYO -80℃超低温冰箱

ABI QuantStudio^TM 3荧光定量PCR仪

哈东联生物安全柜（型号：HDL）

高压灭菌锅（TOMY SX-700）

Eppendorf 离心机

Eppendorf 移液器

2. 实验操作规程和动物处理伦理

模型制作中涉及动物的操作程序已获得中国医学科学院医学实验动物研究所实验动物使用与管理委员会的批准，批准号为LJN22008，简要步骤如下：

2.1 病毒准备：

CA6病毒(购自ATCC，Gdula毒株，GenBank:AY421764.1)，病毒在人横纹肌瘤细胞（RD）中培养、扩增，并采用反复冻融法释放病毒，离心富集病毒。

2.1.1 细胞病毒培养操作：

RD细胞经常规传代培养接种到T75细胞培养瓶，培养至融合度约80%；感染前弃去原培养基，细胞用含2%双抗的PBS 洗2遍，吸出PBS后加入无血清DMEM培养基。接种适量的CA6病毒后，置于37℃ 5% CO₂培养箱孵育1~2h；之后弃去无血清培养基，加入完全培养基继续培养。接种病毒后2~3d细胞病变CPE达到+++～++++，将T75细胞瓶置封口袋中，-80℃超低温冰箱冻化3次。然后将培养液转移至50mL离心管中，4℃ 2000rpm离心20min，沉淀细胞碎片。吸取病毒上清，分装后冻存，并测定病毒滴度TCID₅₀。

2.1.2 组织病毒培养操作：

将CA6病毒以肌肉点注方式感染10日龄ICR乳鼠，三天后取肌肉组织置于适量PBS中研磨均匀，3000rpm离心30min，上清即为病毒液，分装后置于-80℃冰箱保存。

2.2 病毒感染：

根据预实验确定的感染剂量，即病毒滴度为2X10⁵ TCID₅₀/mL的CA6病毒，将病毒经腹腔注射（i.p.）感染小鼠，感染剂量为100μl。对照组注射同等量的PBS。

1. 临床症状表型：

在临床表现及临床评分方面，7日龄小鼠在感染病毒后3 dpi开始出现精神萎靡、体重增加下降、后肢瘫痪等症状，最终全部死亡。感染CA6病毒的乳鼠均未出现皮肤出疹，在6 dpi时平均临床评分为4.7分（图1 A）。在体重变化方面，7日龄小鼠通过i.p.感染CA6病毒后约在3 dpi开始出现体重下降。经感染后的小鼠在6 dpi体重相对于对照组下降了3.3 mg（41.5%），在6 dpi感染组体重均显著低于阴性对照组（P < 0.05）（图1）。

图1. CA6感染小鼠临床症状结果（n = 10）

2. 血液和各组织中CA6病毒复制情况：

7日龄ICR小鼠经i.p.感染CA6后，血液中病毒载量在3dpi达到最高值，超过10⁷ copies/μl。肌肉组织中病毒载量呈现出随感染时间的增加而增多的趋势（图2 A），无论是在3 dpi还是5 dpi，肌肉中病毒载量均远高于其他组织，保持在10⁸ copies/mg。而在其他组织中，病毒载量呈现出先增多后降低的趋势（图2 A、B）。

图2. 腹腔注射感染7日龄ICR小鼠血液与各个组织病毒载量（每个时间点，n = 5）

3. 病理变化情况：

通过H&E染色对经腹腔注射感染CA6的7日龄小鼠的骨骼肌、胸腺、心脏、肺、肝、脾、肾、小肠、脑组织进行病理学检查，发现5dpi小鼠全身多脏器发生损伤和炎症反应。感染小鼠后肢肌肉出现了严重的病理改变，表现为炎细胞浸润、骨骼肌细胞变性坏死、间质水肿等（图3 F）。胸腺中出现胸腺皮质萎缩、淋巴细胞减少等病理改变（图3 G）。在小鼠的心脏组织中，出现了心肌水肿、空泡样变的病理损伤（图3 H）。小鼠脾脏出现髓外造血、白髓萎缩的病理改变（图3 I）。脑组织的病理结果显示，小鼠在感染5天后出现局部神经元周围和网状神经毡可见空泡、尼氏体边集的病理损伤（图3 J）。其他组织并未见到明显病变。

综上所述，在感染CA6后，5dpi的病理观察中肌肉损伤最为严重，主要表现为炎症细胞浸润和骨骼肌细胞变性坏死。

图3. ICR小鼠感染CA6病毒5天组织病理改变

1. 临床症状观察：

在动物在感染手足口病毒后，其症状与临床病人症状并不一致，在手足口病小鼠模型的临床症状常表现为活动减少、竖毛、弓背、肢体瘫痪和死亡，属于部分疾病模型。参考其他手足口病原感染模型以及文献报道，动物感染CA6病毒后观察13天，每天记录体重变化、症状和死亡率。根据症状严重程度，参照以下标准对动物进行临床评分打分：

0分：未见异常；1分：驼背或炸毛；2分：后肢迟缓无力；3分：单后肢瘫痪；4分：双后肢瘫痪；5分：死亡。

根据临床评分标准，在灌胃感染CA6病毒观察期（13天）内，3dpi即可观察到临床症状，且症状持续加重、评分持续升高；4dpi感染动物出现死亡，7dpi死亡率为100%。

2. 感染动物各组织中CA6病毒载量测定：采用实时荧光定量PCR技术-标准曲线法。

采用的特异性引物和Taqman探针：

TCA6-F       （GCCCCTGAATGCGGCTAATCCTAA）

TCA6-R       （CGGACACCCAAAGTAGTCGGTTCC）

CA6-TaqProbe  （FAM- CCATTACGACGCACCACCCCCTGGATTGA -BHQ）

经腹腔感染CA6病毒后，1dpi血液和组织中病毒载量都低于检测阈值。CA6病毒首先在血液中复制达到较高水平，3dpi的检测值10⁶~10⁷ copies/μl，而5dpi下降至10⁵~10⁶ copies/μl；而在后肢肌肉组织中，CA6病毒载量自3dpi便保持高位，10⁷~10⁸ copies/mg，说明病毒在肌肉中发生了大量扩增，具有典型的嗜肌性，与临床症状表现相吻合。在其他组织中，病毒载量大部分在检测阈值之上。

3.病理分析：HE染色

苏木精—伊红染色法（hematoxylin-eosin staining，H&E）是石蜡切片中常用的染色方法：其中苏木精染液呈碱性，可将嗜碱性的细胞核及细胞内核糖体染成蓝紫色；伊红染液呈酸性，将嗜酸性的细胞质及细胞外基质染成红色。

CA6病毒具有明显的嗜肌性，在病理结果上同样可见骨骼肌病理损伤严重，骨骼肌细胞变性坏死、且出现大量炎症细胞浸润、间质水肿等。与后肢肌肉中高病毒载量、后肢瘫痪度临床症状相一致。除后肢肌肉外，在脾脏、胸腺、心脏和脑组织中也能观察到明显的病理变化，尤其是脑组织局部神经元周五和网状神经毡可见空泡、尼氏体边集的病理损伤，说明在小鼠CA6感染模型中也能出现神经性病变。