标识符 | CSTR:16397.09.0B01001452 |
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资源中文名称 | 手足口病柯萨奇病毒A6型腹腔注射感染小鼠模型 |
资源英文名称 | Coxsackievirus A6 intraperitoneally infected mice model |
疾病概述 | 手足口病是由多种肠道病毒引发的病毒性传染病,多发于婴幼儿以及5岁以下儿童。自1998年以来,已经成为世界范围内的重大公共卫生问题。手足口病一般为自限性的,轻症表现为发热和手、足、口腔等部位出现疱疹或斑丘疹,多数患儿一周左右自愈;但少数患儿可引起心肌炎、肺水肿、无菌性脑膜脑炎等重症的神经系统并发症。个别重症患儿病情发展快,可导致死亡。引发手足口病的肠道病毒有20多种(型),主要由肠道病毒(enterovirus)、柯萨奇病毒(coxsakievirus)和埃可病毒(echovirus)组成。 手足口病毒主要通过粪口途径传播,经胃肠道进入机体内。病毒在入侵的局部上皮细胞中完成增殖,然后病毒侵入局部淋巴组织中继续增殖并释放入血导致第一次病毒血症。病毒随血液传播接触到正常靶细胞。病毒表面的VP1蛋白与靶细胞表面特异性受体结合,完成吸附过程,其基因组RNA进入胞质。之后,病毒以其正链RNA作为模板,合成互补的负链RNA,又以负链RNA为模板合成病毒正链RNA,从而得到大量病毒RNA,进入子代病毒颗粒组装阶段。通过转录、翻译,复制出二代病毒,再次释放入血形成第二次病毒血症并引起临床症状。此外,大部分肠道病毒在感染宿主机体时,主要由口腔进入消化道,在肠淋巴组织和感染者的咽部快速繁殖,随淋巴循环进入血液循环,之后侵入到肝、骨髓等处进行大量增殖并再次通过血循环,到达心脏、肺、肝脏等处,大量繁殖造成组织器官病变。 自2008年在芬兰的爆发以柯萨奇病毒A6型(Coxsackievirus A6, CA6)为主要病原的手足口病开始,CA6在世界范围的流行变得更为活跃,且出现了相应的重症病例。在法国、西班牙、美国、日本、泰国等国家都相继报道了CA6的手足口病流行事件,逐渐受到各国重视。2013年以前,中国多地区暴发流行的手足口病病原以EV71和CVA16为主,2013 年以后CA6 和CA10 相关的手足口病的比例逐渐上升,成为国内手足口病感染的优势病原体。在上海、西安、宁波、北京、吉林等地,2012-2013年的手足口病例中CA6所占比例已超过EV71和CA16,成为这些地区的主要致病原。在2017年,广东省爆发了CA6感染导致的大规模的手足口病流行,其中CA6的感染比例高达85.5%。类似的流行趋势也出现在中国其他地区,并呈现增长趋势。 与EV71和CA16相比,CA6引起的手足口病临床特征主要为发热、非典型性疱症和脱甲症。有研究表明,由CA6感染引起的HFMD患者中,脱甲症出现的几率高于EV71和CA16感染。手足口病通常发生在夏季和秋季,但由CA6引起的疾病有着冬季多发的特征。除手足口病之外,感染CA6还通常导致疱症性咽峡炎(HA),这种疾病会表现出口部出现疼痛性水疱的症状。CA6病毒具有五个分支(A-E),并具有两个亚系(E1、E2)。在2011年前,亚洲和欧洲地区D系、E1系和E2系毒株共存。自2008年以来,E2亚型已逐渐成为主要毒株,并导致全球手足口病爆发。 |
实验动物背景信息 | ICR小鼠 |
模型制作方法 | 1.实验材料 1.1 实验动物 SPF级7日龄ICR小鼠乳鼠,购自北京维通利华实验动物技术有限公司和北京华阜康生物科技股份有限公司,由母鼠自然哺乳,在ABSL-2实验室独立饲养。 1.2 主要实验仪器 Olympus光学显微镜 Thermo二氧化碳培养箱 Sigma低温高速离心机 海尔-20℃冰箱 SANYO -80℃超低温冰箱 ABI QuantStudioTM 3荧光定量PCR仪 哈东联生物安全柜(型号:HDL) 高压灭菌锅(TOMY SX-700) Eppendorf 离心机 Eppendorf 移液器 2. 实验操作规程和动物处理伦理 模型制作中涉及动物的操作程序已获得中国医学科学院医学实验动物研究所实验动物使用与管理委员会的批准,批准号为LJN22008,简要步骤如下: 2.1 病毒准备: CA6病毒(购自ATCC,Gdula毒株,GenBank:AY421764.1),病毒在人横纹肌瘤细胞(RD)中培养、扩增,并采用反复冻融法释放病毒,离心富集病毒。 2.1.1 细胞病毒培养操作: RD细胞经常规传代培养接种到T75细胞培养瓶,培养至融合度约80%;感染前弃去原培养基,细胞用含2%双抗的PBS 洗2遍,吸出PBS后加入无血清DMEM培养基。接种适量的CA6病毒后,置于37℃ 5% CO2培养箱孵育1~2h;之后弃去无血清培养基,加入完全培养基继续培养。接种病毒后2~3d细胞病变CPE达到+++~++++,将T75细胞瓶置封口袋中,-80℃超低温冰箱冻化3次。然后将培养液转移至50mL离心管中,4℃ 2000rpm离心20min,沉淀细胞碎片。吸取病毒上清,分装后冻存,并测定病毒滴度TCID50。 2.1.2 组织病毒培养操作: 将CA6病毒以肌肉点注方式感染10日龄ICR乳鼠,三天后取肌肉组织置于适量PBS中研磨均匀,3000rpm离心30min,上清即为病毒液,分装后置于-80℃冰箱保存。 2.2 病毒感染: 根据预实验确定的感染剂量,即病毒滴度为2X105 TCID50/mL的CA6病毒,将病毒经腹腔注射(i.p.)感染小鼠,感染剂量为100μl。对照组注射同等量的PBS。 |
模型表型数据 | 1. 临床症状表型: 在临床表现及临床评分方面,7日龄小鼠在感染病毒后3 dpi开始出现精神萎靡、体重增加下降、后肢瘫痪等症状,最终全部死亡。感染CA6病毒的乳鼠均未出现皮肤出疹,在6 dpi时平均临床评分为4.7分(图1 A)。在体重变化方面,7日龄小鼠通过i.p.感染CA6病毒后约在3 dpi开始出现体重下降。经感染后的小鼠在6 dpi体重相对于对照组下降了3.3 mg(41.5%),在6 dpi感染组体重均显著低于阴性对照组(P < 0.05)(图1)。 图1. CA6感染小鼠临床症状结果(n = 10) 2. 血液和各组织中CA6病毒复制情况: 7日龄ICR小鼠经i.p.感染CA6后,血液中病毒载量在3dpi达到最高值,超过107 copies/μl。肌肉组织中病毒载量呈现出随感染时间的增加而增多的趋势(图2 A),无论是在3 dpi还是5 dpi,肌肉中病毒载量均远高于其他组织,保持在108 copies/mg。而在其他组织中,病毒载量呈现出先增多后降低的趋势(图2 A、B)。 图2. 腹腔注射感染7日龄ICR小鼠血液与各个组织病毒载量(每个时间点,n = 5) 3. 病理变化情况: 通过H&E染色对经腹腔注射感染CA6的7日龄小鼠的骨骼肌、胸腺、心脏、肺、肝、脾、肾、小肠、脑组织进行病理学检查,发现5dpi小鼠全身多脏器发生损伤和炎症反应。感染小鼠后肢肌肉出现了严重的病理改变,表现为炎细胞浸润、骨骼肌细胞变性坏死、间质水肿等(图3 F)。胸腺中出现胸腺皮质萎缩、淋巴细胞减少等病理改变(图3 G)。在小鼠的心脏组织中,出现了心肌水肿、空泡样变的病理损伤(图3 H)。小鼠脾脏出现髓外造血、白髓萎缩的病理改变(图3 I)。脑组织的病理结果显示,小鼠在感染5天后出现局部神经元周围和网状神经毡可见空泡、尼氏体边集的病理损伤(图3 J)。其他组织并未见到明显病变。 综上所述,在感染CA6后,5dpi的病理观察中肌肉损伤最为严重,主要表现为炎症细胞浸润和骨骼肌细胞变性坏死。 图3. ICR小鼠感染CA6病毒5天组织病理改变 |
动物模型的评价与验证 | 1. 临床症状观察: 在动物在感染手足口病毒后,其症状与临床病人症状并不一致,在手足口病小鼠模型的临床症状常表现为活动减少、竖毛、弓背、肢体瘫痪和死亡,属于部分疾病模型。参考其他手足口病原感染模型以及文献报道,动物感染CA6病毒后观察13天,每天记录体重变化、症状和死亡率。根据症状严重程度,参照以下标准对动物进行临床评分打分: 0分:未见异常;1分:驼背或炸毛;2分:后肢迟缓无力;3分:单后肢瘫痪;4分:双后肢瘫痪;5分:死亡。 根据临床评分标准,在灌胃感染CA6病毒观察期(13天)内,3dpi即可观察到临床症状,且症状持续加重、评分持续升高;4dpi感染动物出现死亡,7dpi死亡率为100%。 2. 感染动物各组织中CA6病毒载量测定:采用实时荧光定量PCR技术-标准曲线法。 采用的特异性引物和Taqman探针: TCA6-F (GCCCCTGAATGCGGCTAATCCTAA) TCA6-R (CGGACACCCAAAGTAGTCGGTTCC) CA6-TaqProbe (FAM- CCATTACGACGCACCACCCCCTGGATTGA -BHQ) 经腹腔感染CA6病毒后,1dpi血液和组织中病毒载量都低于检测阈值。CA6病毒首先在血液中复制达到较高水平,3dpi的检测值106~107 copies/μl,而5dpi下降至105~106 copies/μl;而在后肢肌肉组织中,CA6病毒载量自3dpi便保持高位,107~108 copies/mg,说明病毒在肌肉中发生了大量扩增,具有典型的嗜肌性,与临床症状表现相吻合。在其他组织中,病毒载量大部分在检测阈值之上。 3.病理分析:HE染色 苏木精—伊红染色法(hematoxylin-eosin staining,H&E)是石蜡切片中常用的染色方法:其中苏木精染液呈碱性,可将嗜碱性的细胞核及细胞内核糖体染成蓝紫色;伊红染液呈酸性,将嗜酸性的细胞质及细胞外基质染成红色。 CA6病毒具有明显的嗜肌性,在病理结果上同样可见骨骼肌病理损伤严重,骨骼肌细胞变性坏死、且出现大量炎症细胞浸润、间质水肿等。与后肢肌肉中高病毒载量、后肢瘫痪度临床症状相一致。除后肢肌肉外,在脾脏、胸腺、心脏和脑组织中也能观察到明显的病理变化,尤其是脑组织局部神经元周五和网状神经毡可见空泡、尼氏体边集的病理损伤,说明在小鼠CA6感染模型中也能出现神经性病变。 |
保存方式 | 活体 |
合作方式 | 不限定 |
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备注 |