| 标识符 | CSTR:16397.09.0B01001454 |
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| 资源中文名称 | 肠道病毒EV71腹腔注射感染STAT1基因敲除小鼠模型 |
| 资源英文名称 | Enterovirus EV71 intraperitoneally infected STAT1 knockout mouse model |
| 疾病概述 | 手足口病( hand, foot and mouth disease，HFMD)是由多种肠道病毒引发的病毒性传染病，主要传播途径是粪口传播，多发于婴幼儿以及5岁以下儿童。手足口病一般为自限性的，轻症表现为发热和手、足、口腔等部位出现疱疹或斑丘疹，多数患儿一周左右自愈；但少数患儿可引起心肌炎、肺水肿、无菌性脑膜脑炎等重症的神经系统并发症。个别重症患儿病情发展快，可导致死亡。手足口病于1957年在新西兰被发现并以其临床症状而命名，在世界范围内均有流行。在我国2008年开始暴发流行，当年累计病例489540例，死亡127例；其后发病病例呈逐年上升趋势， 2014年至2016年累计7302354例病例。在人群方面，手足口病高发于5岁以下婴幼儿，其中以1~3岁发病率最高，各个年龄段罹患率、重症率、死亡率男性均高于女性，人口密度越大发病率越高。在时间方面，手足口病爆发存在明显季节性特征，尽管全年均有手足口病感染情况，但主要高发于夏季， 4~6月达发病高峰。在地区方面，中国南方一年中存在五月和十月两个发病高峰；而在北方仅有六月一个发病高峰，随着纬度的增加，其半年周期性可能会增强。与此同时，气温、相对湿度、降水、日照时数、气压等气象因素也在该病的传播中起重要作用。自2008年5月2日，手足口病已被我国列为丙类传染病，该病流行已成为严重的公共卫生问题，为我国带来了巨大的经济和健康负担。 引发手足口病的肠道病毒有20多种（型），主要由肠道病毒（enterovirus）、柯萨奇病毒（coxsakievirus）和埃可病毒（echovirus）组成。这些病原均属于小RNA病毒科肠道病毒属（Enterovirus genus），基本结构为无包膜的二十面体，其直径为20-30nm，由核酸和蛋白质组成，是单股正链RNA病毒。病毒基因组含有两个非编码区和一个开放阅读框，开放阅读框编码多聚蛋白；其中VP1基因序列具有高度多样性，且较为稳定，因此可作为肠道病毒属血清型分型依据和评价疫苗效价的生物标志物。手足口病毒主要通过粪口途径传播，经胃肠道进入机体内。病毒在入侵的局部上皮细胞中完成增殖，然后病毒侵入局部淋巴组织中继续增殖并释放入血导致第一次病毒血症。病毒随血液传播接触到正常靶细胞。病毒表面的VP1蛋白与靶细胞表面特异性受体结合，完成吸附过程，其基因组RNA进入胞质。之后，病毒以其正链RNA作为模板，合成互补的负链RNA，又以负链RNA为模板合成病毒正链RNA，从而得到大量病毒RNA，进入子代病毒颗粒组装阶段。通过转录、翻译，复制出二代病毒，再次释放入血形成第二次病毒血症并引起临床症状。 EV71作为手足口病的主要病原，于1969年首次在加利福尼亚神经异常的病人体内分离并鉴定。最近几十年，EV71感染引起的手足口病疫情在世界范围内大爆发，主要集中于亚太地区。我国自2008年开始发生手足口病流行以来，EV71一直是主要的流行病原，且该病毒感染伴随严重的并发症几率相对较高，包括脑干脑炎、无菌性脑膜炎、肺水肿或肺出血、急性弛缓性麻痹和心力衰竭；因此一直是手足口病研究的重点。STAT1是机体免疫系统实现抗病毒、减少组织损伤的的媒介之一，在许多抗病毒感染进程中扮演重要角色。STAT1介导的JAK/STAT 信号通路在EV71病毒感染过程中可以发挥抗病毒的作用，同时EV71病毒也可以影响STAT1信号通路的激活。 |
| 实验动物背景信息 | STAT1基因敲除小鼠（STAT-/- C57BL/6） |
| 模型制作方法 | 1. 实验材料 1.1 实验动物 1.2 主要实验仪器 Olympus光学显微镜 Thermo二氧化碳培养箱 Sigma低温高速离心机 海尔-20℃冰箱 SANYO -80℃超低温冰箱 ABI QuantStudioTM 3荧光定量PCR仪 哈东联生物安全柜（型号：HDL） 高压灭菌锅（TOMY SX-700） Eppendorf 离心机 Eppendorf 移液器 2. 实验操作规程和动物处理伦理 模型制作中涉及动物的操作程序已获得中国医学科学院医学实验动物研究所实验动物使用与管理委员会的批准，批准号为LJN21002，简要步骤如下： 2.1 STAT1基因敲除小鼠的鉴定： 采用的检测引物为： STAT1-KO-S 5’ GAGAGTAATTTAATGGTTGGGCTC TM= 63 STAT1-KO-A 5’ CATGTGAGTCCTGTATCCCTCTAATAGTAAC TM=62 鉴定结果如下（图1）：  图1. STAT1基因敲除小鼠纯合子和杂合子鉴定电泳图 2.2 病毒准备： EV71病毒为FY0805毒株经小鼠传代所获得的适应株MP10（GenBank accession number:HQ712020）。组织病毒培养操作： 将EV71病毒以肌肉点注方式感染10日龄ICR乳鼠，三天后取肌肉组织置于适量PBS中研磨均匀，3000rpm离心30min，上清即为病毒液，分装后置于-80℃冰箱保存。 2.3 病毒感染： 根据预实验确定的感染剂量，即病毒滴度为105 TCID50/mL的EV71病毒，将病毒经腹腔注射感染小鼠，感染剂量为100μl。感染小鼠包括：野生型C57BL/6小鼠、纯合子STAT-/- C57BL/6小鼠和杂合子STAT+/- C57BL/6小鼠。 |
| 模型表型数据 | 1.临床症状表型： 2. 血液和组织中病毒复制情况： 感染3天后，对不同小鼠的后肢肌肉进行病毒载量检测，结果显示：3组动物肌肉的病毒载量都达到了108copies/mg；而STAT1 -/-小鼠的肌肉病毒载量明显高于WT组与STAT1+/-组，在统计学意义上具有显著性差异（P＜0.01）（图2D）。说明EV71病毒在肌肉组织中大量复制扩增。
图2. EV71感染对STAT1-/- C57BL/6小鼠病理生理状况以及血清病毒载量的影响 3. 病理变化情况： 利用HE染色对小鼠后肢肌肉的病理变化进行观察，利用免疫荧光技术对不同组小鼠后肢肌肉中EV71抗原的表达量进行了对比。结果见图3。 对EV71抗原荧光染色结果显示，EV71抗原在小鼠后肢肌肉中有聚集现象，与WT组相比，这种现象在STAT1-/-小鼠中更加明显（图3B），据此推测EV71在STAT-/-小鼠后肢肌肉中复制水平增高。与WT组及STAT1+/-组相比，STAT1-/-小鼠表现出大片炎性细胞浸润与组织纤维化（图3A），组织损伤情况更为严重。 从生存率、病毒载量、HE染色等检测指标可见，STAT1基因敲除小鼠抵抗EV71病毒感染复制的能力存在严重缺陷，可能是导致EV71病毒感染加重的原因。
图3. EV71感染对STAT1-/- C57BL/6小鼠炎症损伤及病毒复制的影响 |
| 动物模型的评价与验证 | 1. 临床症状观察： 在动物在感染手足口病毒后，其症状与临床病人症状并不一致，在手足口病小鼠模型的临床症状常表现为活动减少、竖毛、弓背、肢体瘫痪和死亡，属于部分疾病模型。参考其他手足口病原感染模型以及文献报道，动物感染EV71病毒后观察13天，每天记录体重变化、症状和死亡率。根据症状严重程度，参照以下标准对动物进行临床评分打分： 0分：未见异常；1分：驼背或炸毛；2分：后肢迟缓无力；3分：单后肢瘫痪；4分：双后肢瘫痪；5分：死亡。 根据临床评分标准，在观察期（9天）内，WT和STAT1基因敲除动物在第4天都可观察到临床症状，且症状持续加重、评分持续升高；纯合子STAT1-/-第4天即出现死亡，WT动物在第6天才出现死亡，而此时STAT1-/-已全部死亡；最终观察期结束时WT的存活率为40%，而杂合子STAT1+/-存活率为30%。 2. EV71病毒载量测定方法：采用实时荧光定量PCR技术-标准曲线法。 采用的特异性引物： EV71-S1 (5’-AGATAGGGTGGCAGATGTAATTGAAAG-3’)； EV71-A1 (5’-TAGCATTTGATGATGCTCCAATTTCAG-3’) 动物在腹腔感染EV71病毒后第3天WT和STAT1基因敲除小鼠肌肉中病毒载量均值都超过108 copies/mg，说明病毒在肌肉中都大量扩增；且纯合子STAT1-/-病毒载量最高，与其临床症状表现和存活率的结果相吻合。 3.病理分析：
（1）HE染色 苏木精—伊红染色法（hematoxylin-eosin staining，H&E）是石蜡切片中常用的染色方法：其中苏木精染液呈碱性，可将嗜碱性的细胞核及细胞内核糖体染成蓝紫色；伊红染液呈酸性，将嗜酸性的细胞质及细胞外基质染成红色。 EV71病毒具有明显的嗜肌性，在病理结果上同样可见骨骼肌病理损伤严重，骨骼肌细胞变性坏死、且出现大量炎症细胞浸润；而纯合子STAT1-/-的炎症严重程度最强，杂合子STAT1+/-次之。 （2）免疫荧光分析 免疫荧光染色利用抗EV71单克隆抗体（1：500）作为一抗，4℃过夜，随后0.01M PBS清洗3次，鼠抗兔IgG（H+L）作为二抗（1:200）孵育1h，0.01M PBS清洗后附荧光抗体，在激光共聚焦显微镜下观察。 组织免疫荧光分析同样发现纯合子STAT1-/-中EV71 VP1的分布最多。病理结果、免疫荧光结果跟病毒载量、临床症状表现相一致。 |
| 保存方式 | 活体 |
| 合作方式 | 不限定 |
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| 备注 |
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