科萨其病毒、鼻病毒、人呼吸道合胞病毒可能与SARS-COV2合并感染加重症状并导致是高致死率。人呼吸道合胞病毒、鼻病毒等不但在我国的儿童和老年人中有一定的流行，而且是易突变的RNA病毒。而这几种呼吸道病毒目前没有实用的动物模型。建立这些呼吸道病毒的动物模型，不仅可以研究SARS-cov2合并感染的致病机制和优化治疗方案、也可为人呼吸道合胞病毒、鼻病毒的防治提供模型。 更重要的是可为这类病毒突变引起的未来威胁提供前瞻性模型储备。

利用CRISPR/Cas9的方法构建基因敲入小鼠。

科萨其病毒、鼻病毒、人呼吸道合胞病毒可能与SARS-COV2合并感染加重症状并导致是高致死率。人呼吸道合胞病毒、鼻病毒等不但在我国的儿童和老年人中有一定的流行，而且是易突变的RNA病毒。而这几种呼吸道病毒目前没有实用的动物模型。建立这些呼吸道病毒的动物模型，不仅可以研究SARS-cov2合并感染的致病机制和优化治疗方案、也可为人呼吸道合胞病毒、鼻病毒的防治提供模型。 更重要的是可为这类病毒突变引起的未来威胁提供前瞻性模型储备。

利用CRISPR/Cas9的方法构建基因敲入小鼠。

2019年末首次发现的SARS-CoV-2引发了许多变异毒株（VOC），对人类健康构成重大威胁。2021年底奥密克戎BA.1.1的出现导致了2022年初的疫情。根据现有病例资料，新型冠状病毒肺炎以发热、干咳、乏力等为主要表现，少数患者伴有鼻塞、流涕、腹泻等上呼吸道和消化道症状。重症病例多在1周后出现呼吸困难，严重者快速进展为急性呼吸窘迫综合征、脓毒症休克、难以纠正的代谢性酸中毒和出凝血功能障碍及多器官功能衰竭等。值得注意的是重症、危重症患者病程中可为中低热，甚至无明显发热。轻型患者仅表现为低热、轻微乏力等，无肺炎表现。从目前收治的病例情况看，多数患者愈后良好，少数患者病情危重。老年人和有慢性基础疾病者愈后较差。疫苗及抗体类药物上市使用后，很大程度上缓解了病情，但对于疫情传播蔓延收效甚微，主要原因是变异株的陆续出现。自2020年第陆续出现的Beta, Delta, Omicron等变异株对现有疫苗的保护效果带来极大挑战。针对变异株，主要关注其致病力变化以及现有疫苗和药物的保护效果，而动物模型是开展此类研究的必须工具。

1. 动物感染实验 使用来自北京华阜康生物科技股份有限公司的无特定病原体（SPF）hACE2转基因小鼠（6-8周龄）进行小鼠实验。北京协和医学院实验动物科学研究所菌毒种中心提供了SARS-CoV-2原型株（SARS-CoV-2/WH-09/human/2020/CHN；基因库：MT093631.2）和奥密克戎BA.1型（基因库：OM095411.1）。小鼠经鼻接种1×105TCID50/只剂量的SARS-CoV-2原型株和奥密克戎BA.1。感染后，持续观察和记录感染小鼠的体重、临床症状和死亡情况。在感染后1、3、5和7天（dpi），对小鼠实施安乐死，采集血液、肺和气管，以评估病毒载量、组织病理学和免疫细胞变化。 2. 病毒复制检测 使用TRIzol试剂从组织和器官匀浆中提取总RNA。根据制造商的说明，使用定量探针RT-PCR试剂盒进行定量实时PCR。从已知浓度的重组质粒的一系列10倍稀释液中制作标准曲线。基于核衣壳蛋白（N）基因的SARS-CoV-2引物序列如下：探针：TTGCTGCTGCTTGACAGATT；正向引物，5′-GGGAACTCTCTCGCTAGAAT′；反向引物5′-CAGACATTTTGCTCTCAAGCTG′。RT-qPCR反应采用以下循环方案和引物处理进行：50°C 2分钟，95°C 2 min，然后在95°C下进行40次循环15 s和60°C 30 s，最后在95℃下进行15 s、60°C 1 min和95°C 45 s。 3. 组织病理学分析 石蜡切片（厚度4 μm）用H&E和免疫组织化学（IHC）染色，并在光学显微镜下观察。对肺石蜡切片进行脱蜡。将切片浸入0.01M柠檬酸盐缓冲液中并加热以进行抗原修复。然后阻断切片中的内源性过氧化物酶10分钟。随后，将切片在10%山羊血清中封闭1小时。将切片与抗MAC-2（稀释比1:1000）、抗Ly6G（稀释比1:200）和抗SARS-CoV-2刺突S1蛋白（稀释比1:50）单克隆抗体在4°C下混合过夜。第二天，将切片与HRP标记的绵羊抗大鼠/兔IgG二级抗体孵育，使用3,3'-二氨基联苯胺四氢氯化物（DAB）进行可视化，并用苏木精进行复染。 4. 免疫细胞分析 采集小鼠外周血和肺组织。用剪刀剪碎肺组织，然后转移到含有胶原酶Ⅰ和胶原酶Ⅱ的DMEM培养基中。消化45分钟后，通过70 μm过滤器获得单细胞悬浮液。外周血和肺的单细胞悬浮液在黑暗中用荧光团缀合的抗小鼠抗体在4°C下染色30分钟。然后在室温下用红细胞裂解缓冲液处理。洗涤后，用4%多聚甲醛固定板。处理后在BD LSRFortessa上进行流式细胞术采集，并使用Flow-jo软件分析所有数据。

手足口病是一种常见的病毒性传染病，有少数患儿可迅速发展为重症的神经系统并发症，导致比较严重的炎症反应，如无菌性脑炎、神经性肺水肿等，病死率较高。手足口病（HFMD）是一个全球性的健康问题。手足口病的病原体为肠道病毒，包含20多种类型，其中人肠道病毒71型（EV71）感染主要引发严重的疾病，随着EV71疫苗于2016年上市，EV71引发的重症手足口病发病率和致死率显著下降，但是其它病原体例如CA6引发的病例逐渐上升，因此有必要构建CA6感染模型，为致病机制研究、疫苗和药物研发提供动物模型。

1．病毒毒株 本实验储存 CA6 临床分离株（ATCC®VR-1801™） 2．实验动物为7日龄 SPF 级Balb/c小鼠，体重 4-6g；购于斯贝福（北京）生物技术有限公司【SYXK(京)2019-0030】。于中国医学科学院医学实验动物研究所动物生物安全二级实验室（ABSL-2）中进行实验。实验动物的使用严格遵循3R原则，本实验得到了中国医学科学院医学实验动物研究所动物使用和管理委员会的批准（批准号：LJN22008）。 3．实验动物分组：观察组、实验组。 （1）病毒感染：7日龄小鼠灌胃感染CA6病毒，体积为100微升，感染1次感染剂量为1×106.5TCID50/只。 （2）取材：在感染1、3、 5、7天后，取材小鼠的血液、脑、脑干、心、肝、肺、胃、大肠、小肠、肌肉、脊髓。血液 150ul，组织各取材30mg。 （3）生存率分析和临床症状评分：感染小鼠每天观察症状，并每天称重，记录死亡率和临床症状评分。观察周期为12天，12天后，存活的乳鼠实施安乐死。 （4）实验结束后，所有母鼠实施安乐死。

ALS，又称“肌萎缩侧索硬化”（amyotrophic lateral sclerosis）。是运动神元病最常见的一种类型。ALS确切的发病原因尚不明确，表现为进行性的肢体无力，肌肉萎缩和肌束震颤。发病初期可表现为手指和上肢的无力，并且进展为下肢和躯干的无力，严重时可累及呼吸肌，出现呼吸肌麻痹。本病不累及感觉系统，高级智能也不受累及。

利用Cas9/sgRNA注射受精卵的方法构建基因敲入小鼠。

抑郁症是常见的精神疾病之一，患者常表现出持续性的心境低落、兴趣减退、睡眠障碍、食欲紊乱和社交恐惧等临床症状，可诱发肥胖、心血管疾病等并发症，对患者的身心健康及生活质量构成了严重威胁。虽然针对抑郁症已经开展了大量深入研究，但仍然无法找到其确切的发病机制。抑郁症不仅是精神疾病，更是一种脑部病变，尤其是中重度的抑郁症，脑部病变较为明显，其主要表现为：第一个是大脑里面的神经递质，包括五羟色胺（5-HT）、去甲肾上腺素（NA）、多巴胺（DA）等神经递质浓度下降；第二个改变就是出现脑萎缩，尤其是大脑和海马的萎缩比较明显。Nectin-like 4（Necl4）是Necl家族的成员，它表达广泛，遍及人体脑、脾、肾、前列腺、睾丸、膀胱等组织，其中脑组织表达量最高。Necl家族蛋白因与Nectin家族有类似的结构而得名，该家族也被称为细胞黏附分子（cellular adhesion molecules，CADMs），隶属于免疫球蛋白超家族，能够参与突触的形成、轴突导向、神经细胞迁移等，在神经系统功能研究中备受关注。Necl4作为细胞黏附分子中的一员，其在突触中的功能和在抑郁症中的作用同样值得探究。

在本实验中，首先从Invitrogen公司获得含有Necl4的基因组DNA的BAC克隆，之后用诱导型Cre重组酶基因(CRE-ERT2)和新霉素耐药基因（NeoR）取代Necl4的第一外显子构建基因靶向载体。通过电穿孔方法将线性化的靶向载体导入小鼠胚胎干细胞（ES）中。在新霉素选择后，用限制性内切酶Spe Ⅰ 酶切ES克隆的基因组DNA，酶切后的野生型等位基因长度为8.9kb，突变型等位基因长度为7.3kb。用3´侧翼探针进行 Southern杂交，筛选出198个独立的ES克隆。最终鉴定出5个同源重组克隆，并将其中2个克隆注射到囊胚中，产生嵌合体小鼠进行生殖系传递，产生F1杂合子小鼠，后续利用F1杂合小鼠交配，获得Necl4纯合敲除小鼠。

Zhu, Y., Li, H., Li, K., Zhao, X., An, T., Hu, X., Park, J., Huang, H., Bin, Y., Qiang, B., Yuan, J., Peng, X., and Qiu, M. (2013) Necl-4/SynCAM-4 is expressed in myelinating oligodendrocytes but not required for axonal myelination. PloS one 8, e64264. 胡耕，刘枭，舒鹏程，彭小忠。 突触黏附分子 NECL4对大脑皮质 Ca2+ -CaMKII-CDC42信号通路的影响。 基础医学与临床40,2020,7(7) :929-933. （3）Liu, X., Ran, K., Hu, G., Yin, B., Qiang, B., Han, W., Shu, P., and Peng, X. (2023) Indispensable role of Nectin-like 4 in regulating synapse-related molecules, synaptic structure, and individual behavior. FASEB J 37, e22970

多发性线粒体功能障碍综合征（multiple mitochondrial dysfunction Syndrome，MMDS）是一种在临床上死亡率极高的遗传性线粒体疾病，临床症状为神经系统损伤、肌肉张力下降、呼吸功能不全等。MMDS发病机制复杂且并未被阐明，目前没有有效的治疗方案。Isca1基因编码蛋白参与线粒体铁硫簇生物合成中铁的募集和传递，临床发现该基因的纯合突变是MMDS5的致病突变，患者携带Isca1突变。但目前的研究主要集中在临床诊断和病例报告中，缺少致病机制研究和相应动物模型。

在本实验中，我们利用Isca1flox/flox大鼠和NeuN-Cre大鼠进行杂交，繁育得到Isca1flox/flox-NeuN-Cre大鼠。NeuN-Cre大鼠是将Cre酶的编码序列插入到NeuN基因的下游，使Cre酶与NeuN蛋白共用同一套启动子并有同样的表达模式，而NeuN为神经元特异表达的蛋白，因此只有神经元能转录翻译Cre酶。Cre酶能识别基因组中34bp的flox序列，特异性剪切两个flox序列之间的DNA序列。Isca1flox/flox大鼠是在Isca1基因第三外显子的两端插入flox序列，因此当与NeuN-Cre大鼠杂交后，神经元中的Cre酶会特异性剪切Isca1基因的第三外显子，导致Isca1基因的特异性敲除。 Isca1 flox/+由本实验室在前期构建。NeuN-Cre大鼠来源于国家人类疾病动物模型资源库，编号为CSTR:16397.09.0L02000541。 图1 Isca1基因神经元特异性敲除大鼠的繁育策略

Sheng H, Lu D, Qi X, Ling Y, Li J, Zhang X, Dong W, Chen W, Gao S, Gao X, Zhang L, Zhang L. A neuron-specific Isca1 knockout rat developments multiple mitochondrial dysfunction syndromes. Animal Model Exp Med. 2023 Apr;6(2):155-167.

自闭症谱系障碍(Autism Spectrum Disorder, ASD)，也称孤独症（autistic disorder）谱系障碍，是一种广泛性发展障碍（pervasive developmental disorder，PDD）的一种代表性疾病，现多使用于儿童身上。其病征包括异常的语言能力、异常的交往能力、狭窄的兴趣以及固执刻板的行为模式。临床诊断依据是核心行为异常包括社交障碍和陈规定型行为。儿童自闭症是儿童精神类疾病当中最为严重的一种。 孤独症的患病率报道不一，2005年报道称10000人中约有60人患病，2007年，110名儿童就有1人患病，男孩比女孩更为常见，男女比例约为3～4：1，男孩比女孩。目前中国的孤独症患者可能超过1000万，0~14岁患者或超200万，并以每年近20万的速度增长。自闭症的病因至今仍然不明，也没有有效药物能够治愈，世界公认的可以改善自闭症症状的只有“科学干预”。 自闭症的成因极为复杂，可能是涉及遗传学因素、免疫因素、生化因素、孕产期因素等，造成了特定脑结构或脑功能的损伤所致。至于损伤的具体脑区、分子机制如何，仍待进一步研究。

 1. 实验材料 1.1 实验动物 Wistar大鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司和北京华阜康生物科技股份有限公司。 1.2 主要实验仪器 Nikon显微注射仪 Nikon光学显微镜 BIO-RAD电泳仪 Tanon电泳槽 Tanon数码凝胶图像处理系统 Incucell恒温培养箱温控 TAITEC振荡箱 Eppendorf离心机 Eppendorf移液器 2.实验操作规程和动物处理伦理 模型制作中涉及动物的操作程序已获得中国医学科学院医学实验动物研究所实验动物使用与管理委员会的批准，批准号为MYW22004，简要步骤如下： 2.1 供卵雌鼠超排 实验第一天8：00 腹腔注射PMSG 30IU/只(0.6ml／只)，46～48h以后，实验第三天10：00 腹腔注射HCG 30IU/只(0.6ml／只)，注射HCG后立即与与种鼠1：1合笼。实验第四天8：00～9：00检查阴道栓，有阴道栓的大鼠在大鼠标牌上注明日期和⊕（阳性），捡出有阴栓的大鼠进行受精卵的收集。 2.2 受精卵的收集   2%戊巴比妥钠麻醉大鼠，脱颈处死，解剖大鼠，找到卵巢，输卵管和子宫，将卵取出，用透明质酸酶消除胚泡的黏着，使卵分离。在移换到另外的培养液中，要将透明质酸酶充分洗净（洗约3~5次）。 2.3 向受精卵雄性原核注入DNA溶液 2.4. 仅将未损坏的完成操作的卵收集起来，移植到假妊娠大鼠输卵管中。术后将大鼠置于安静的环境下饲养。 2.5 基因表型鉴定 在判定有导入基因大鼠之后，立即将基因修饰大鼠另行饲养，对不用的大鼠进行处理。阴性大鼠的处理：（1）留和阳性大鼠等量的阴性大鼠对照。（2）剩余的阴性大鼠用于其它符合动物伦理的其他实验室的实验（保存记录）。 3.基因敲除靶点设计与基因型鉴定 利用CRISPR/Cas9 技术建立基因敲除大鼠，sgRNA 的作用靶点位于第2外显子，包括sgRNA 1(CCACCATGGTGGGCATGTACT) 和 sgRNA2 (CCTGGCACAGTAAACAGAGTC)。Cas9 蛋白 (30 ng/μL), sgRNAs (10 ng/μL)混合物进行显微注射，获得基因编辑大鼠。使用引物1：5’GCAAACTACCACATCATTCCCAG-3’，和引物2：5’CTGTGTCCATCAGCTCAGATCAG-3’进行基因型鉴定。 

Pang S, Luo Z, Dong W, Gao S, Chen W, Liu N, Zhang X, Gao X, Li J, Gao K, Shi X, Guan F, Zhang L, Zhang L. Integrin β1/FAK/SRC signal pathway is involved in autism spectrum disorder in Tspan7 knockout rats. Life Sci Alliance. 2022 Dec 20;6(3):e202201616. doi: 10.26508/lsa.202201616. PMID: 36625203; PMCID: PMC9768919.

线粒体相关疾病

Xiaolong Qi , Lei Tan, Xu Zhang , Jiachuan Jin , Weining Kong, Wei Chen, Jianying Wang , Wei Dong, Lijuan Gao , Lijun Luo , Dan Lu , Jianan Gong , Feifei Guan , Wenjie Shu , Xingxu Huang , Lianfeng Zhang , Shengqi Wang , Bin Shen , Yuanwu Ma; Expanding DdCBE-mediated targeting scope to aC motif preference in rat; Mol Ther Nucleic Acids;2023 Feb 26;32:1-12.

线粒体相关疾病

Xiaolong Qi , Lei Tan, Xu Zhang , Jiachuan Jin , Weining Kong, Wei Chen, Jianying Wang , Wei Dong, Lijuan Gao , Lijun Luo , Dan Lu , Jianan Gong , Feifei Guan , Wenjie Shu , Xingxu Huang , Lianfeng Zhang , Shengqi Wang , Bin Shen , Yuanwu Ma; Expanding DdCBE-mediated targeting scope to aC motif preference in rat; Mol Ther Nucleic Acids;2023 Feb 26;32:1-12.

线粒体相关疾病

Xiaolong Qi , Lei Tan, Xu Zhang , Jiachuan Jin , Weining Kong, Wei Chen, Jianying Wang , Wei Dong, Lijuan Gao , Lijun Luo , Dan Lu , Jianan Gong , Feifei Guan , Wenjie Shu , Xingxu Huang , Lianfeng Zhang , Shengqi Wang , Bin Shen , Yuanwu Ma; Expanding DdCBE-mediated targeting scope to aC motif preference in rat; Mol Ther Nucleic Acids;2023 Feb 26;32:1-12.

线粒体相关疾病

Xiaolong Qi , Lei Tan, Xu Zhang , Jiachuan Jin , Weining Kong, Wei Chen, Jianying Wang , Wei Dong, Lijuan Gao , Lijun Luo , Dan Lu , Jianan Gong , Feifei Guan , Wenjie Shu , Xingxu Huang , Lianfeng Zhang , Shengqi Wang , Bin Shen , Yuanwu Ma; Expanding DdCBE-mediated targeting scope to aC motif preference in rat; Mol Ther Nucleic Acids;2023 Feb 26;32:1-12.