近年来由柯萨奇A6型（CA6）引起的手足口病所占比例逐年增加。目前已有的CA6动物模型多使用小鼠作为模式动物，采用CA6小鼠适应株经过灌胃会腹腔注射感染，但尚缺乏使用临床分离株模拟天然感染途径经灌胃感染的小鼠模型。本课题组采用Balb/c小鼠，使用临床分离毒株，通过灌胃感染CA6，观察动物症状及反应，测定了病毒在体内复制情况及组织病理学损伤，分析了各项模型指标。

1．病毒毒株 本实验储存 CA6 临床分离株（ATCC®VR-1801™）

2．实验动物为7日龄 SPF 级Balb/c小鼠，体重 4-6g；购于斯贝福（北京）生物技术有限公司【SYXK(京)2019-0030】。于中国医学科学院医学实验动物研究所动物生物安全二级实验室（ABSL-2）中进行实验。实验动物的使用严格遵循3R原则，本实验得到了中国医学科学院医学实验动物研究所动物使用和管理委员会的批准（批准号：LJN22008）。

3．实验动物分组：观察组、实验组。

（1）病毒感染：7日龄小鼠灌胃感染CA6病毒，体积为100微升，感染1次感染剂量为1×10^6.5TCID₅₀/只。

（2）取材：在感染1、3、 5、7天后，取材小鼠的血液、脑、脑干、心、肝、肺、胃、大肠、小肠、肌肉、脊髓。血液 150ul，组织各取材30mg。

（3）生存率分析和临床症状评分：感染小鼠每天观察症状，并每天称重，记录死亡率和临床症状评分。观察周期为12天，12天后，存活的乳鼠实施安乐死。

（4）实验结束后，所有母鼠实施安乐死。

7日龄Balb/c小鼠通过灌胃感染方式接种CA6病毒，连续观察12天记录临床评分、体重、生存率。观察以灌胃途径感染CA6后小鼠生存率变化，CA6感染小鼠于第8天全部死亡。CA6病毒感染导致小鼠体重为下降趋势。感染后小鼠的临床症状，发现在4 d.p.i.时出现后肢瘫痪症状。灌胃感染的小鼠症状比较严重，且有高致死率。

7日龄Balb/c小鼠通过灌胃方式感染CA6病毒，于感染后第5、7 天取材血液、肌肉、心、肺、肝、胃、小肠、大肠、大脑、脑干、脊髓，经荧光实时定量PCR法检测病毒载量。观察病毒在小鼠体内分布的异同。检测感染后5、7天小鼠血液、肌肉病毒载量，发现5、7天血液与肌肉的病毒载量变化趋势一致，5、7天血液的病毒载量在10⁴ Copies/μL左右；肌肉的病毒载量为10⁷ Copies/mg左右，且有显著性差异。感染后7天心脏、肝、小肠病毒载量降低。5 d.p.i 时心脏、肝脏、大脑病毒载量大于10⁴ Copies/mg，7d.p.i时下降为小于10⁴ Copies/mg，其中心脏的病毒载量5d.p.i与7d.p.i，有显著性差异；5 d.p.i 与7d.p.i时脊髓中病毒载量基本持平，均为10⁵ Copies/mg。由小鼠临床症状可知病毒感染主要表现为肌肉损伤，感染后5、7天肌肉中病毒载量高达为10⁷ Copies/mg，肌肉中病毒载量为各个组织中最高。进一步探讨CA6病毒在小鼠其他组织中的复制扩增情况，采用荧光实时定量PCR 法对5d.p.i和7d.p.i小鼠心、肺、肝、胃、小肠、大肠、大脑、脑干、脊髓进行病毒核酸检测。据实验室前先研究确定以病毒载量以10⁴ Copies/mg为界，超过即认为病毒在该组织内存在大量扩增，在CA6感染小鼠中，5d.p.i心脏、肝脏、大脑和脊髓中病毒载量较高；7d.p.i只有脊髓的病毒载量较高，其余各个组织病毒载量明显偏低。

根据临床症状发现CA6病毒感染后,小鼠后肢出现明显瘫痪症状，通过核酸检测发现在肌肉组织均检测到病毒核酸，证明病毒己进入各组织器官并进行扩增复制，因此取后肢骨骼肌制作病理切片进行H&E染色，观察组织病理变化。对比NC组，发现感染组小鼠组织有明显病理损伤。临床表现发现病毒主要要导致小鼠后肢瘫痪，且病理切片表明后肢骨骼肌病理损伤最为严重，表现为组织中可见大面积肌纤维坏死，核溶解，伴有较多结缔组织增生，及淋巴细胞与中性粒细胞点状浸润。

Balb/c小鼠灌胃感染7天后肌肉病理改变（n=6）

在CA6感染引起的脑炎、肺水肿并发症的患者体内，炎症细胞因子水平明显升高，因此在使用本动物模型进行疫苗开发、药物评价等，有必要考虑细胞因子的变化情况。基于以上考虑，增加了灌胃感染后的炎性细胞因子的检测，结果表明灌胃同样会引起炎症反应。小鼠血清中 11种炎症相关细胞因子的变化情况。部分炎症相关细胞因子（GRO-alpha、IFN-gamma、IL-1beta、IL-1beta、IL-1beta、IL-12p70、IL-23、IL-27）的水平与同期采集的阴性对照组无显著性差异；IL-18、IL-2、IL-6、TNA-alpha的水平与同期采集的阴性对照组有显著性差异，以上数据表明，灌胃感染同腹腔等其他感染方式一样，可以引起机体的炎症反应。

灌胃感染CA6病毒后血清中细胞因子变化情况（n=5-7）

获得中国实验动物学会模型鉴定委员会颁发的B类动物模型证书。