膀胱癌（bladder cancer）是指发生在膀胱黏膜上的恶性肿瘤。是泌尿系统最常见的恶性肿瘤，也是全身十大常见肿瘤之一。

1.表达载体构建：构建chicken β-actin-luc-NEO载体。CAG启动子由巨细胞病毒（the cytomegalovirus，CMV)早期增强子（early enhancer element）和鸡β-肌动蛋白（ chicken beta-actin ）启动子组成，用于驱动基因在哺乳动物载体的高水平表达（图1）。       图1 带有荧光素酶基因表达载体的构建 2. BTT739-eGFP荧光细胞的获得：采用脂质体2000转染小鼠膀胱癌移行细胞，转染后24 h，用含有G418的培养液筛选细胞三周，获得稳定表达luciferase的细胞株，选择其中高表达的克隆株扩大培养，细胞形态见图2。 图2 BTT739-eGFP细胞形态 3. 肿瘤细胞的植入及活体荧光成像：收集处于生长对数期的转染细胞，稀释至5×106／mL。取T739小鼠进行皮下接种，1×106个细胞/只。观察前每只小鼠腹腔注射饱和三溴乙醇(0.18 mL/10 g)麻醉后放入活体荧光影像系统摄像，Slide Book 4.0软件进行分析。

肿瘤（tumour）是指机体在各种致瘤因子作用下，局部组织细胞增生所形成的新生物（neogrowth），因为这种新生物多呈占位性块状突起，也称赘生物（neoplasm）。根据新生物的细胞特性及对机体的危害性程度，又将肿瘤分为良性肿瘤和恶性肿瘤两大类，而癌症即为恶性肿瘤的总称。

构建小鼠p53基因打靶载体(图1)，p53引入一个无义突变，电转入ES细胞获得经基因修饰的打靶干细胞克隆，显微注射ES细胞到C57小鼠的受精卵中，移植到假孕小鼠，获得崁合体后代小鼠，再和C57小鼠杂交，最终获得可以传代的p53-/-小鼠(图2)。 图1 p53基因打靶载体的构建 图2  Western bolt 检测p53-/-小鼠胚胎内p53表达 1-3杂合子4-6野生 7-9纯合子

1．Donehower LA, Harvey M, Slagle BL, McArthur MJ, Montgomery CA, Butel JS and Bradley A. Mice deficient for p53 are developmentally normal but susceptible to spontaneous tumours[J]. Nature, 1992, 356, 215–221. 2．Kemp CJ, Wheldon T and Balmain A. p53-deficient mice are extremely susceptible to radiation-induced tumorigenesis[J]. Nat. Genet., 1994, 8, 66–69. 3．Donehower LA, Harvey M, Vogel H, McArthur MJ, Montgomery CA, Park SH, Thompson T, Ford RJ and Bradley A. Effects of genetic background on tumorigenesis in p53-deficient mice[J]. Mol. Carcinogen., 1995, 14, 16–22. 

阿尔茨海默症（Alzheimer disease，AD）是一种常见的中枢神经系统退行性变性疾病

引进Jackson实验室 B6;129-Psen1tm1Mpm Tg(APPSwe,tauP301L)1Lfa/J 品系，其背景品系为B6129SF2/J ，其制作方法是用显微注射法将线性化的转基因载体（APPSwe,tauP301L）注射到B6;129-Psen1tm1Mpm携带PS1插入突变的小鼠的受精卵中。转基因小鼠PCR法鉴定基因型。Western blot检测转基因小鼠脑组织中人APP和TAU蛋白的表达（图1）。 该品系为混合遗传背景，经与C57小鼠回交6次以上得到了B6- Psen1tm1Mpm Tg(APPSwe,tauP301L) 三转AD小鼠。   图1 Psen1tm1Mpm Tg(APPSwe,tauP301L) 三转AD小鼠的建立

帕金森病（Parkinson’s disease，PD）

构建带有神经特异性启动子的质粒PDGF-h-α-synuclein-A30P，用显微注射法将线性化转基因质粒注射到C57BL/6J小鼠受精卵中，以C57BL/6J小鼠作假孕受体。

高宁，全雄志，陈炜，李万波，刘鹏，冯娟，张连峰，秦川. 帕金森病α-Synuclein转基因小鼠模型的建立[J]. 中国比较医学杂志. 2008. 18(5).

胰腺癌是一种恶性程度很高，诊断和治疗都很困难的消化道恶性肿瘤，约90%为起源于腺管上皮的导管腺癌。其发病率和死亡率近年来明显上升。5年生存率<1%，是预后最差的恶性肿瘤之一。胰腺癌恶性度高，病程短，一般出现症状时已属晚期，并很快发生转移，侵犯邻近脏器。胰头癌与胰体尾癌的转移途径不完全一致，胰头部癌常侵犯到胆总管、十二指肠、胃及腹腔动脉，其淋巴转移途径主要是经肠系膜上动脉周围淋巴结向五动脉周围淋巴结转移。胰体、尾部癌常沿神经鞘向腹腔神经丛及脊髓方向转移，或沿淋巴管转移至胰上及肝门淋巴结等处。本病发病率男性高于女性，男女比率为1.5～2:1，男性患者远较绝经前的妇女多见，绝经后妇女的发病率与男性相仿。

将对数生长期的SW1990-eGFP细胞皮下接种于2只BALB/c裸鼠，接种细胞数量为1×106/只, 采用活体荧光影像系统摄像动态观察。模型制作采用的BALB/c裸鼠，鼠龄5周，体重15—18 g，在无特定病原体(specific—pathogen free，SPF)的饲养间饲养。

人胰腺癌是一种恶性程度很高，诊断和治疗都很困难的消化道恶性肿瘤，约90%为起源于腺管上皮的导管腺癌。其发病率和死亡率近年来明显上升。5年生存率<1%，是预后最差的恶性肿瘤之一。胰腺癌恶性度高，病程短，一般出现症状时已属晚期，并很快发生转移，侵犯邻近脏器。胰头癌与胰体尾癌的转移途径不完全一致，胰头部癌常侵犯到胆总管、十二指肠、胃及腹腔动脉，其淋巴转移途径主要是经肠系膜上动脉周围淋巴结向五动脉周围淋巴结转移。胰体、尾部癌常沿神经鞘向腹腔神经丛及脊髓方向转移，或沿淋巴管转移至胰上及肝门淋巴结等处。本病发病率男性高于女性，男女之比为1.5～2:1，男性患者远较绝经前的妇女多见，绝经后妇女的发病率与男性相仿。

将对数生长期的Capan-2-DsRed细胞皮下接种于2只BALB/c裸鼠，接种细胞数量为1×106/只, 采用活体荧光影像系统摄像动态观察。模型制作采用的BALB/c裸鼠，鼠龄5周，体重15—18 g，在无特定病原体(specific—pathogen free，SPF)的饲养间饲养。

李小颖 苏卫 张连峰，SW1990和Capan-2红色荧光标记胰腺癌移植肿瘤模型的建立和比较，中国比较医学杂志，2010年第20卷第3期。

胰腺癌是一种恶性程度很高，诊断和治疗都很困难的消化道恶性肿瘤，约90%为起源于腺管上皮的导管腺癌。其发病率和死亡率近年来明显上升。5年生存率<1%，是预后最差的恶性肿瘤之一。胰腺癌恶性度高，病程短，一般出现症状时已属晚期，并很快发生转移，侵犯邻近脏器。胰头癌与胰体尾癌的转移途径不完全一致，胰头部癌常侵犯到胆总管、十二指肠、胃及腹腔动脉，其淋巴转移途径主要是经肠系膜上动脉周围淋巴结向五动脉周围淋巴结转移。胰体、尾部癌常沿神经鞘向腹腔神经丛及脊髓方向转移，或沿淋巴管转移至胰上及肝门淋巴结等处。本病发病率男性高于女性，男女之比为1.5～2:1，男性患者远较绝经前的妇女多见，绝经后妇女的发病率与男性相仿。

将对数生长期的SW1990-DsRed细胞皮下接种于2只BALB/ c裸鼠，接种细胞数量为1×106/只, 采用活体荧光影像系统摄像动态观察。模型制作采用的BALB/ c裸鼠，鼠龄5周，体重15—18 g，在无特定病原体(specific—pathogen free，SPF)的饲养间饲养。

人胰腺癌是一种恶性程度很高，诊断和治疗都很困难的消化道恶性肿瘤，约90%为起源于腺管上皮的导管腺癌。其发病率和死亡率近年来明显上升。5年生存率<1%，是预后最差的恶性肿瘤之一。胰腺癌恶性度高，病程短，一般出现症状时已属晚期，并很快发生转移，侵犯邻近脏器。胰头癌与胰体尾癌的转移途径不完全一致，胰头部癌常侵犯到胆总管、十二指肠、胃及腹腔动脉，其淋巴转移途径主要是经肠系膜上动脉周围淋巴结向五动脉周围淋巴结转移。胰体、尾部癌常沿神经鞘向腹腔神经丛及脊髓方向转移，或沿淋巴管转移至胰上及肝门淋巴结等处。本病发病率男性高于女性，男女比率为1.5～2:1，男性患者远较绝经前的妇女多见，绝经后妇女的发病率与男性相仿。

将对数生长期的PANC-1-DsRed细胞皮下接种于2只BALB/c裸鼠，接种细胞数量为1×106/只, 采用活体荧光影像系统摄像动态观察。模型制作采用的BALB/c裸鼠，鼠龄5周，体重15—18 g，在无特定病原体(specific—pathogen free，SPF)的饲养间饲养。

人肠道病毒71型（EV71）是微核糖核酸病毒科肠病毒属肠病毒种A型RNA病毒， 1969年首次在加利福尼亚神经异常的病人体内分离并鉴定。EV71被认为是婴幼儿手足口病(HFMD)的主要病原体之一。该病毒感染偶尔伴随严重的并发症，包括脑干脑炎、无菌性脑膜炎、肺水肿或肺出血、急性弛缓性麻痹和心力衰竭。最近几十年，EV71感染引起的手足口病疫情在世界范围内大爆发，目前主要集中于亚太地区。中国大陆的EV71病毒感染始见于1987年冬季湖北省HFMD的流行，自1999年以来，我国广东、福建、上海、重庆等地区也报告了局部流行的EV71感染，与1998年台湾地区报道120,000例爆发手足口病，其中有78例死亡不同，大陆EV71引起的HFMD和神经系统症状较轻。以往研究认为人脊髓和脑干是EV71感染的靶标，但其感染机制和致病机制尚不明确。 2009年日本学者首次利用细胞实验鉴定了EV71的两种人受体蛋白，分别为P选择素糖蛋白配体1(P-selectin glycoprotein ligand-1，PSGL-1)和人清道夫受体B2（SCARB2）。通过建立表达PSGl-1的转基因小鼠，我们证实人PSGL-1有一定的促进EV71感染转基因小鼠的功能。为进一步在体内证实人SCARB2的受体功能，以期改良现有的EV71感染小鼠模型，我们通过建立表达人SCARB2基因的转基因小鼠，在体内验证了该蛋白的受体功能。

pCMV6-XL5-h-SCARB2质粒购自美国Origene公司（Clone ID NM_002257）。EcoR I和Xho I酶切回收h-SCARB2片段，并克隆入pCDNA3.1(+)质粒中巨细胞瘤病毒（CMV）启动子下游，构建全身表达人SCARB2的载体。转基因载体经测序验证后，用Pvu I将载体线性化，Sephedex G50柱纯化。将DNA浓度调整至5 ng/uL，用显微注射法将DNA注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中，用ICR小鼠作假孕受体，制备转基因小鼠。经鼠尾DNA PCR对首建鼠的基因型进行鉴定，得到阳性首建鼠3只（图1A）。随后，用逆转录PCR分析了首建鼠F1代组织中目的基因的表达情况，发现人SCARB2主要在转基因小鼠的骨骼肌和脑组织中表达（图1B）。随后，分别用Western Blot和免疫组化分析了人SCARB2蛋白在脑和骨骼肌组织中的表达情况。由于人SCARB2与小鼠SCARB2同源性较高，存在抗体交叉结合现象。Western Blot发现转基因小鼠脑和骨骼肌组织中SCARB2蛋白表达量高于同窝阴性（图1C-1D）。免疫组化发现SCARB2蛋白主要分布于转基因小鼠的骨骼肌和脑组织中（图2A-2B），该结果表明成功建立了脑和肌肉组织表达人SCARB2蛋白的转基因小鼠。 图1 人SCARB2转基因小鼠的构建及鉴定注：M：DNA分子质量标准；1-15：首建鼠；NTG：同窝阴性小鼠；TG：转基因小鼠；A：PCR鉴定阳性首建鼠；B：逆转录PCR分析转基因小鼠组织内人SCARB2基因表达；C： Western Blot分析人SCARB2蛋白在转基因小鼠脑组织中的表达，GAPDH为内参；D： Western Blot分析人SCARB2蛋白在转基因小鼠骨骼肌组织中的表达，GAPDH为内参。 Note: M: DNA molecular weight standard; Lane1-15:Transgenic mouse line;  NTG: Negative littermates; TG: Transgenic mice; A:Transgenic mice lines identification by PCR using the tail genomic DNA as template; B: Reverse-transcriptase PCR analysis the human SCARB2 gene expression in tissues of Tg mice; C: Western blot  detected the expression of human SCARB2 protein synthesis in brain of Tg mice; D: Western blot  detected the expression of human SCARB2 protein synthesis in muscle of Tg mice. The data were normalized to GAPDH expression Fig.1 Establishment and identification of the transgenic mice expressing human SCARB2.   注： NTG：同窝阴性小鼠；TG：转基因小鼠； A-B：21日龄小鼠脑和肌肉的免疫组；SCARB2蛋白如黑色箭头所示。放大倍数为：100×。 图2 SCARB2转基因小鼠的免疫组化鉴定 Note: NTG: Negative littermates; TG: transgenic mice; A-B: immunohistochemical analysis of brain and  muscle of 21-day TG mice and the positions of SCARB2 protein are denoted with black arrows, respectively. Magnification: 100×. Fig.2 Immunohistochemical identification of the SCARB2 transgenic mice

1.修晶辉,刘江宁,杨亚军,夏咸柱,张连峰.人SCARB2蛋白提高人肠道病毒71型对转基因小鼠的感染力.中国比较医学杂志,2013, 23（7）:16-20.

胰腺癌是一种恶性程度很高，诊断和治疗都很困难的消化道恶性肿瘤，约90%为起源于腺管上皮的导管腺癌。其发病率和死亡率近年来明显上升。5年生存率<1%，是预后最差的恶性肿瘤之一。胰腺癌恶性度高，病程短，一般出现症状时已属晚期，并很快发生转移，侵犯邻近脏器。胰头癌与胰体尾癌的转移途径不完全一致，胰头部癌常侵犯到胆总管、十二指肠、胃及腹腔动脉，其淋巴转移途径主要是经肠系膜上动脉周围淋巴结向五动脉周围淋巴结转移。胰体、尾部癌常沿神经鞘向腹腔神经丛及脊髓方向转移，或沿淋巴管转移至胰上及肝门淋巴结等处。本病发病率男性高于女性，男女之比为1.5～2:1，男性患者远较绝经前的妇女多见，绝经后妇女的发病率与男性相仿。

 将对数生长期的Capan-2-LUC细胞原位接种于2只BALB/c裸鼠胰腺，接种细胞数量为1×106/只, 分别在第7,14,21,28d观察一次，观察前每只裸鼠腹腔注射荧光素底物D-Luciferin（1.5mg/10g）,饱和三溴乙醇（0.18ml/10g）麻醉后放入活体荧光影响系统摄像，Slide Book 4.0软件进行分析。模型制作采用的BALB/c裸鼠，鼠龄5周，体重15—18 g，在无特定病原体(specific—pathogen free，SPF)的饲养间饲养。

糖尿病是由遗传因素、免疫功能紊乱、微生物感染及其毒素、自由基毒素、精神因素等等各种致病因子作用于机体导致胰岛功能减退、胰岛素抵抗等而引发的糖、蛋白质、脂肪、水和电解质等一系列代谢紊乱综合征，临床上以高血糖为主要特点，典型病例可出现多尿、多饮、多食、消瘦等表现，即“三多一少”症状，糖尿病(血糖)一旦控制不好会引发并发症，导致肾、眼、足等部位的衰竭病变，且无法治愈。糖尿病(Diabetes)分1型糖尿病、2型糖尿病、妊娠糖尿病及其他特殊类型的糖尿病。在糖尿病患者中，2型糖尿病所占的比例约为95%。2型糖尿病原名叫成人发病型糖尿病，多在35～40岁之后发病。

利用CRISPR/Cas9技术制备瘦素受体（Leptin receptor）基因敲除大鼠，获得一个在瘦素受体所在基因组上从90043bp to 90341bp位置缺失 298-bp碱基，并插入了4个碱基，在瘦素受体基因序列上产生了终止密码子TGA，在蛋白水平上来看共缺失了997个氨基酸。Western blot显示，该大鼠无法正常表达功能性完整的瘦素受体蛋白。 图1  瘦素受体敲除大鼠肝脏组织中瘦素受体的表达情况

Bao Dan, Yuanwu Ma,Xu Zhang, etc. Preliminary Characterization of a Leptin Receptor Knockout Rat Created by CRISPR/Cas9 System (已接收，未在线)

1型糖尿病，又名胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)或青少年糖尿病，易出现糖尿病酮症酸中毒(DKA)。又叫青年发病型糖尿病，这是因为它常常在35岁以前发病，占糖尿病的10%以下。1型糖尿病是依赖胰岛素治疗的，也就是说病友从发病开始就需使用胰岛素治疗，并且终身使用。原因在于1型糖尿病由于自身免疫的损害造成胰岛β细胞破坏，引起胰岛素对对缺乏，呈现高血糖症状，即出现糖尿病。

该模型是从美国杰克逊实验室引入，近交系，小鼠全称NOD/ShiLtJ，简称NOD，编号是001976。