携带A53T突变人α突触核蛋白转基因帕金森病大鼠模型。

背景品系为SD(Sprague Dawley, SD)大鼠 ，为大鼠（rat；rattus norregicus）的一个品系，属于动物界、脊索动物门、脊椎动物亚门、哺乳纲、啮齿目、鼠科、大家鼠属（Genus Rattus）、大家鼠种（Species rattus norvegicus）的动物，1925年，美国斯泼累格•多雷（Sprague Dawley）农场用Wistar大鼠培育而成。

将人类α–syn A53T突变基因插入到脑组织特异启动子PDGF的下游，构建α –syn A53T表达载体。用显微注射法将线性化的转基因载体注射到SD大鼠的受精卵中，用Wistar大鼠作假孕受体，制备转基因大鼠。转基因大鼠在出生7 d，用碱裂解法提取基因组DNA。PCR法鉴定转基因首建鼠及其子代基因型。Western blot检测转基因大鼠脑组织中人α –synuclein蛋白的表达。（图1）

图1 α –synA53T转基因大鼠的建立

a. PDGF-α –syn A53T表达载体的构建

b. α –syn A53T转基因阳性鼠PCR检测。M，DL2000 DNA marker；泳道1-5、8、10-11、13为阴性；泳道6、7、9、12分别为1、8、10、36号阳性首建鼠。

c. western blot 检测转基因首建鼠脑组织中α –synuclein蛋白的表达。WT，同窝阴性对照鼠；36#、1#、8#为阳性首建鼠。GAPDH 为加样一致性对照。

1. 转基因表达α –syn A53T导致大鼠中脑TH阳性神经元数目减少

酪氨酸羟化酶(TH)是多巴胺（DA）能神经元合成的限速酶，通过检测TH阳性细胞数目及TH蛋白表达情况可反映多巴胺神经元功能状态。取1月龄和7月龄转基因大鼠及同窝阴性对照鼠中脑组织切片进行免疫荧光和免疫组化染色。结果发现，1月龄对照鼠中脑黑质TH阳性神经元形态正常、数目丰富，而转基因鼠TH阳性神经元数目和对照鼠相比没有显著变化； 7月龄转基因鼠TH阳性神经元数目和对照鼠相比显著减少（69%，P <0.05，图2），且形态异常。

图2 免疫荧光或者免疫组化检测转基因大鼠中脑黑质TH阳性神经元的数目变化

WT，同窝阴性对照鼠；Tg为α –synA53T转基因大鼠; 1M, 1月龄; 7M, 7月龄。

2. 转基因表达α –syn A53T导致大鼠中脑神经元胞浆内α –synulcien 聚集

取7月龄转基因大鼠及同窝阴性对照鼠中脑黑质组织切片进行免疫荧光染色发现，和对照鼠相比，转基因鼠中脑黑质神经元出现α –synuclein 阳性着色，且和酪氨酸羟化酶(TH)阳性的神经元共定位，提示α –synuclein在多巴胺能神经元中特异表达（图3）。免疫组化显示，黑质致密部虽无典型的路易小体出现，但神经元胞浆内有大量的α –synuclein聚集，而且α –synuclein阳性黑质神经元形态异常，较对照组中脑黑质神经元体积小（图4）。

图3  IF检测人α -synuclein蛋白在转基因大鼠脑黑质多巴胺神经元中的表达

WT，同窝阴性对照鼠；Tg为α –synA53T转基因大鼠；DAPI,  DAPI即4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole)，TH, 酪氨酸羟化酶(TyrosineHydroxylase,TH)；α-syn, α突触核蛋白（α -synuclein）；Merge，图像叠加。

图4  IHC检测人α -synuclein蛋白在转基因大鼠脑黑质多巴胺神经元中的表达

WT，同窝阴性对照鼠；Tg为α –synA53T转基因大鼠

3. 转基因表达α –syn A53T导致大鼠动作协调能力下降

选取7月龄转基因大鼠和同窝阴性对照鼠分别进行Rotating rod实验，发现转基因大鼠较阴性对照大鼠在转棒仪上运动时间减短，动作协调能力下降。7月龄阴性对照雄鼠（n=6）在转棒仪上平均潜伏期为40.3 s，而转基因雄鼠(n=14)平均潜伏期为7.3 s，下降约40%。7月龄阴性对照雌鼠（n=5）在转棒仪上平均潜伏期为180 s，而转基因雌鼠（n=7）平均潜伏期为70s，下降约60%。进行t检验，7月龄转基因大鼠较阴性对照组统计结果均为P<0.05(图5)。

图5 7月龄转基因大鼠Rotating rod实验

WT，同窝阴性对照鼠；Tg为α –synA53T转基因大鼠。

4. 转基因表达α –syn A53T导致大鼠步态障碍

7月龄转基因大鼠（n=8）和同窝阴性对照鼠（n=5）步态实验结果显示，与对照组比，转基因组前肢步宽、后肢步宽、左前摆时长、左后摆时长、右前摆时长、左后足迹最大面积和右前足迹最大面积等7项指标有显著性的变化（表1）。转基因大鼠的前肢步宽加大了47%（P<0.01），后肢步宽加大了34%（P<0.05），左前摆时长、左后摆时长和右前摆时长分别缩短了11%（P<0.05）、12%（P<0.05）和14%（P<0.01）。转基因大鼠的左后足迹最大面积和右前足迹最大面积分别减小了39%（P<0.05）和16%（P<0.01）。

表1  7月龄转基因大鼠步态实验

注：↑, 增加; ↓, 减少。