小鼠乳腺癌细胞4T1来自ATCC，是从410.4瘤株中未经诱变筛得的6-硫鸟嘌噙抗性细胞株。 当注射到BALB/c 小鼠中时，4T1自发产生高转移肿瘤，可转移到肺，肝，淋巴结和大脑，同时在注射部位形成始发灶。 诱导转移时不需要摘除始发灶。4T1细胞在BALB/c小鼠中的生长与转移特性与人体中的乳腺癌十分相近。

细胞接种动物为BALB/c小鼠，BALB/c 是白色变种实验室用鼠，起源于小家鼠Mus musculus，广泛用于免疫学、生理学的动物实验。

1.表达载体构建：构建chicken β-actin-luc-NEO载体。CAG启动子由巨细胞病毒（the cytomegalovirus，CMV)早期增强子（early enhancer element）和鸡β-肌动蛋白（ chicken beta-actin ）启动子组成，用于驱动基因在哺乳动物载体的高水平表达（图1）。

图1 荧光素酶基因表达载体的构建

2. 4T1-LUC荧光细胞系的获得：采用脂质体2000转染小鼠乳腺癌细胞4T1细胞，转染后24 h，用含有G418的培养液筛选细胞三周，获得稳定表达luciferase的细胞株，选择其中高表达的克隆株扩大培养。

3.肿瘤细胞的植入及活体荧光成像：收集处于生长对数期的转染细胞，稀释至5×10⁶／mL。取0.1 mL细胞悬液接种于BALB／c小鼠（5周龄，体重15-18 g）右侧第二对乳腺脂肪垫内。1×10⁶个细胞/只，接种后每隔一周，采用活体荧光影像系统摄像动态观察肿瘤的生长和转移情况。观察前每只小鼠腹腔注射荧光素底物(1.5 mg/10 g)，饱和三溴乙醇(0.18 mL/10 g)麻醉后放人活体荧光影像系统摄像，Slide Book 4．0软件进行分析。

1. 4T1-Luc小鼠乳腺癌细胞原位接种

本模型将Luc基因转染到小鼠乳腺癌细胞4T1中得到了高表达luciferase细胞株。取0.1 mL 4T1-Luc细胞悬液接种于BALB／c小鼠右侧第二对乳腺脂肪垫内。用活体荧光成像系统连续观察，发现7d能够成瘤，21d肿瘤面积显著增大，35d后原位肿瘤面积变小，但能够观察到肺转移（图2）。

7d   　　   　　      21d       　　　    35d

图2 小鼠乳腺癌4T1乳腺脂肪垫接种

2.原位接种细胞剂量与肺转移

标记细胞稀释成1×10⁷ 细胞／mL，2×10⁷细胞／mL，5×10⁷细胞／mL和1×10⁸细胞／mL四种剂量，取0.1 mL接种于BALB／c小鼠右侧第二对乳腺脂肪垫内，制作小鼠原位乳腺癌模型，比较肿瘤细胞在小鼠体内生长及肺转移情况。结果，四种剂量细胞接种BALB／c小鼠后，均有肿瘤生长，但四种剂量接种的原位移植瘤均发生转移程度不同，最终确定接种1×10⁶个细胞／只不仅肺转移明显，而且存活时间一般超过45 d，比高剂量接种存活时间长，为最佳肺转移剂量（见图3）。

图3 荧光素酶标记4T1小鼠乳腺癌细胞在体生长与转移的影像分析

3. 模型优点与应用

尾静脉途径建立的肿瘤转移模型仅涉及肿瘤转移的最后阶段，是实验性转移而非自发转移，未能真实的反应肿瘤细胞自发转移的特性。与尾静脉接种相比，乳腺原位自发转移模型不仅真实反应了肿瘤细胞在体的转移特性，而且能完整地呈现肿瘤转移的全过程，为探讨肿瘤转移的生物学机制和抗转移治疗提供了理想的动物模型，利用这种模型和活体动物体内光学成像系统可以实现活体、动态和即时的转移肿瘤分析。

66c14与4T1和4T07细胞模型比较。将Luc标记的4T1、66c14、4T07细胞对BALB／c小鼠乳腺原位接种4T1细胞乳腺原位移植瘤最大，66c14细胞瘤体次之，4T07细胞瘤体最小；接种后35 d，三株细胞乳腺原位移植瘤大小较一致。4T1和66c14原位移植瘤均可发生转移，其中4T1细胞较66c14细胞转移最为严重，而4T07细胞未见转移。