免疫相关疾病动物模型

Crispr/cas9技术制作TLR8敲除小鼠。

免疫相关疾病动物模型

Crispr/cas9技术制作TLR6敲除小鼠。

免疫相关疾病动物模型

Crispr/cas9技术制作TLR5敲除小鼠。

免疫相关疾病动物模型

Crispr/cas9技术制作TLR3敲除小鼠。

免疫相关疾病动物模型

Crispr/cas9技术制作TLR7敲除小鼠。

免疫相关模型

利用CRISPR/Cas9技术敲除IL11第二个外显子，建立IL11敲除大鼠。  

新型冠状病毒肺炎（COVID-19）是由新型冠状病毒（SARS-CoV-2）引起的一场波及全球的流行性疾病。

利用CRISPR/Cas9技术将人ACE2基因插入到大鼠ACE2基因启动子后，建立ACE2人源化大鼠。

新型冠状病毒肺炎（COVID-19）是由新型冠状病毒（SARS-CoV-2）引起的一场波及全球的流行性疾病。

利用CRISPR/Cas9技术将人ACE2基因插入到大鼠ACE2基因启动子后，建立ACE2人源化大鼠。

新型冠状病毒肺炎（COVID-19）是由新型冠状病毒（SARS-CoV-2）引起的一场波及全球的流行性疾病。

利用CRISPR/Cas9技术制备人ACE2转基因大鼠，人ACE2基因构建在细胞角蛋白18(K18)的启动子后。

新型冠状病毒肺炎（COVID-19）是由新型冠状病毒（SARS-CoV-2）引起的一场波及全球的流行性疾病。

利用CRISPR/Cas9技术制备人CD147转基因大鼠，人CD147基因构建在细胞角蛋白18(K18)的启动子后。

新型冠状病毒肺炎（COVID-19）是由新型冠状病毒（SARS-CoV-2）引起的一场波及全球的流行性疾病。

利用CRISPR/Cas9技术制备人NPR1转基因大鼠，人NPR1基因构建在细胞角蛋白18(K18)的启动子后。

1.病原学 乳头瘤病毒（Papillomaviruses, PV）为无包膜双链DNA病毒，可感染粘膜和/或皮肤上皮细胞，具有高度宿主特异性。人乳头瘤病毒（human papillomaviruses, HPV）可导致人类宫颈癌、皮肤癌、口腔癌、肛门癌等恶性病变，目前尚无针对HPV感染后病变或引起恶性癌症的治疗方法。由于病毒的宿主特异性，HPV感染人，不能感染其它动物，这限制了病毒感染动物模型的建立。 2011年印度科学家发现小鼠乳头瘤病毒（Mouse papillomavirus type 1, MmuPV1）可感染实验室小鼠品系，首次为乳头瘤状病毒感染小鼠实验模型制备提供机会。与HPV一样，MmuPV1也属于乳多空病毒科乳头瘤病毒属，由闭合环状双链DNA分子组成，其长度为7510bp，含有一条编码链，至少编码7个ORFs。 乳头瘤病毒对热敏感，70℃ 30分钟可灭活，但在室温干燥环境下3天，病毒活力仍有50%。乙醇、异丙醇、戊二醛、邻苯二甲醛、苯酚等常用消毒剂均无法杀灭病毒。0.55%次氯酸钠和1.2%过氧乙酸可灭活病毒。

小鼠尾部MmuPV1感染 三溴乙醇小鼠麻醉，按每公斤体重腹腔注射240mg。待小鼠麻醉后，利用刀片在小鼠尾部反复轻轻刮擦20次左右，取10μl病毒液（6×108 VGE）滴加到刮擦过的尾部。每周观察2次，待尾部病变直径接近1cm时，安乐小鼠并收集肿瘤。部分肿瘤组织置于福尔马林固定液用于组织学研究；部分肿瘤组织置于液氮中速冻，并保存于-80℃进行后续感染和分子研究。 小鼠尾部MmuPV1 DNA提取 使用分离柱法分离组织DNA。取MmuPV1感染尾部的增生部位，利用DNeasy Blood & Tissue Kit （Qiagen）。提取方法如下：将25mg切成尽量小块置于1.5ml EP管中，加入180μl Buffer ATL及20μl Proteinase K，震荡混匀，56℃孵育1-3h至增生组织完全裂解，孵育期间间断震荡；震荡15s，加入200μl Buffer AL，震荡充分混合，加入200μl无水乙醇，再次充分震荡混匀；混合物转移至DNeasy Mini spin column，6,000×g（8,000 rpm）离心1min，弃废液；柱子中加入500μl Buffer AW1，6000×g（8000 rpm）离心1min，弃废液；柱子中加入500μl Buffer AW2，20,000×g（14,000 rpm）离心3min，弃废液；将珠子置于新的1.5ml或2ml离心管，在柱子的膜上加200μl Buffer AE，室温静置1min，≥6000×g（8000 rpm）离心1min。 小鼠尾部MmuPV1的PCR检测 将小鼠尾部增生组织置于PBS中，利用匀浆器高速匀浆3min。匀浆液10，000 rpm离心3min，将上清液转移到新1.5ml EP管中。配置反应体系，上下游引物分别为对MmuPV1 E2基因，MmuPV1_E2_1（5`- GCC CGA AGA CAA CAC CGC CAC G-3`）和MmuPV1_E2_2（5'-CCT CCG CCT CGT CCC CAA AAA ATG G-3'）。反应条件：95℃ 10min；95℃ 15s；60℃ 60s，68℃ 45s，40个循环；68℃ 10min。 小鼠尾部MmuPV1感染组织病理学检测 安乐小鼠，解剖采集尾部增生部位皮肤，进行苏木精-伊红（HE染色）。方法简述：组织块经10%的多聚甲醛固定、脱水透明后，置于熔化的石蜡中进行包埋，进而制作石蜡切片；切片脱蜡后进行HE染色；进一步的脱水透明，封片，显微镜下观察。 RNAscope原位杂交 安乐小鼠，解剖采集尾部增生部位皮肤置于10%多聚甲醛固定、脱水透明后，置于熔化的石蜡中进行包埋，进而制作石蜡切片，切片进行后续RNAscope原位杂交，具体实验步骤如下： （1）载玻片脱蜡：60℃烤片1h，二甲苯脱蜡2次，每次5min，100%酒精2次，每次1min，切片朝上放到吸水纸上，室温静置干燥5min； （2）双氧水靶标修复：切片滴加约5-8滴RNAscope®双氧水，室温孵育10min，蒸馏水清洗切片3-5次后，将载玻片浸没到煮沸的1×RNAscope®靶标修复液中放置15min，蒸馏水清洗3-5次，100%乙醇中清洗1次，室温静置干燥； （3）画疏水圈：使用ImmedgeTM疏水笔在样本周围化疏水圈2-4次； （4）将载玻片置于HybEZTM载玻片架中，滴加5滴RNAscope®蛋白酶plus，放入HybEZTM湿盒，放回40℃杂交炉 30min。蒸馏水洗3次； （5）探针杂交：载玻片滴加4滴E1^E4探针，再放入湿盒，杂交炉40℃孵育2h，将载玻片浸没于1×清洗缓冲液中，室温，每次2min； （6）杂交Amp1：载玻片上滴加4滴Amp1，放回湿盒，杂交炉杂交炉40℃孵育30min，将载玻片浸没于1×清洗缓冲液中，室温，每次2min； （7）杂交Amp2：载玻片上滴加4滴Amp2，放回湿盒，杂交炉杂交炉40℃孵育15min，将载玻片浸没于1×清洗缓冲液中，室温，每次2min； （8）杂交Amp3：载玻片上滴加4滴Amp3，放回湿盒，杂交炉杂交炉40℃孵育30min，将载玻片浸没于1×清洗缓冲液中，室温，每次2min； （9）杂交Amp4：载玻片上滴加4滴Amp4，放回湿盒，杂交炉杂交炉40℃孵育15min，将载玻片浸没于1×清洗缓冲液中，室温，每次2min； （10）杂交Amp5：载玻片上滴加4滴Amp5，放回湿盒，杂交炉杂交炉40℃孵育30min，将载玻片浸没于1×清洗缓冲液中，室温，每次2min； （11）杂交Amp6：载玻片上滴加4滴Amp6，放回湿盒，杂交炉杂交炉40℃孵育15min，将载玻片浸没于1×清洗缓冲液中，室温，每次2min； （12）信号检测：弃掉液体后，载玻片上滴加120μl DAB工作液，室温静置10min，去除DAB工作液，蒸馏水洗3-5次； （13）载玻片复染：载玻片放入苏木精染色液中，室温静置2min，蒸馏水洗3-5次，利用0.02%氨水洗一次，蒸馏水再洗3-5次； （14）载玻片脱水：载玻片放入70%乙醇，室温静置2min，100%酒精，室温静置2min，100%酒精，室温静置2min，二甲苯溶液，室温静置5min； （15）封片：载玻片风干后，滴加1滴Cytoseal封片剂，盖上盖玻片，风干载玻片5min。 转录组差异分析 TRIzol法提取尾部增生皮肤（实验组）及尾部正常皮肤（空白对照组）样本RNA，通过琼脂糖凝胶电泳分析RNA完整性及是否有DNA污染、Nanodrop进行RNA浓度和纯度检测。送到北京诺禾致源科技股份有限公司测序平台进行RNA测序。通过文库构建并测序获得原始测序序列后进行信息分析流程，主要由两个阶段：a）评估测序数据质量；b）信息挖掘及分析。将实验组与对照组RNA-seq序列进行对比，鉴定分析差异基因表达和聚类分析（包括差异基因数目统计、GO富集分析、KEGG通路富集分析），采用edgeR软件进行表达差异显著性分析。