免疫相关疾病动物模型

Crispr/cas9技术制作TLR5敲除小鼠。

免疫相关疾病动物模型

Crispr/cas9技术制作TLR3敲除小鼠。

免疫相关疾病动物模型

Crispr/cas9技术制作TLR7敲除小鼠。

免疫相关模型

利用CRISPR/Cas9技术敲除IL11第二个外显子，建立IL11敲除大鼠。  

新型冠状病毒肺炎（COVID-19）是由新型冠状病毒（SARS-CoV-2）引起的一场波及全球的流行性疾病。

利用CRISPR/Cas9技术将人ACE2基因插入到大鼠ACE2基因启动子后，建立ACE2人源化大鼠。

新型冠状病毒肺炎（COVID-19）是由新型冠状病毒（SARS-CoV-2）引起的一场波及全球的流行性疾病。

利用CRISPR/Cas9技术将人ACE2基因插入到大鼠ACE2基因启动子后，建立ACE2人源化大鼠。

新型冠状病毒肺炎（COVID-19）是由新型冠状病毒（SARS-CoV-2）引起的一场波及全球的流行性疾病。

利用CRISPR/Cas9技术制备人ACE2转基因大鼠，人ACE2基因构建在细胞角蛋白18(K18)的启动子后。

新型冠状病毒肺炎（COVID-19）是由新型冠状病毒（SARS-CoV-2）引起的一场波及全球的流行性疾病。

利用CRISPR/Cas9技术制备人CD147转基因大鼠，人CD147基因构建在细胞角蛋白18(K18)的启动子后。

新型冠状病毒肺炎（COVID-19）是由新型冠状病毒（SARS-CoV-2）引起的一场波及全球的流行性疾病。

利用CRISPR/Cas9技术制备人NPR1转基因大鼠，人NPR1基因构建在细胞角蛋白18(K18)的启动子后。

1.病原学 乳头瘤病毒（Papillomaviruses, PV）为无包膜双链DNA病毒，可感染粘膜和/或皮肤上皮细胞，具有高度宿主特异性。人乳头瘤病毒（human papillomaviruses, HPV）可导致人类宫颈癌、皮肤癌、口腔癌、肛门癌等恶性病变，目前尚无针对HPV感染后病变或引起恶性癌症的治疗方法。由于病毒的宿主特异性，HPV感染人，不能感染其它动物，这限制了病毒感染动物模型的建立。 2011年印度科学家发现小鼠乳头瘤病毒（Mouse papillomavirus type 1, MmuPV1）可感染实验室小鼠品系，首次为乳头瘤状病毒感染小鼠实验模型制备提供机会。与HPV一样，MmuPV1也属于乳多空病毒科乳头瘤病毒属，由闭合环状双链DNA分子组成，其长度为7510bp，含有一条编码链，至少编码7个ORFs。 乳头瘤病毒对热敏感，70℃ 30分钟可灭活，但在室温干燥环境下3天，病毒活力仍有50%。乙醇、异丙醇、戊二醛、邻苯二甲醛、苯酚等常用消毒剂均无法杀灭病毒。0.55%次氯酸钠和1.2%过氧乙酸可灭活病毒。

小鼠尾部MmuPV1感染 三溴乙醇小鼠麻醉，按每公斤体重腹腔注射240mg。待小鼠麻醉后，利用刀片在小鼠尾部反复轻轻刮擦20次左右，取10μl病毒液（6×108 VGE）滴加到刮擦过的尾部。每周观察2次，待尾部病变直径接近1cm时，安乐小鼠并收集肿瘤。部分肿瘤组织置于福尔马林固定液用于组织学研究；部分肿瘤组织置于液氮中速冻，并保存于-80℃进行后续感染和分子研究。 小鼠尾部MmuPV1 DNA提取 使用分离柱法分离组织DNA。取MmuPV1感染尾部的增生部位，利用DNeasy Blood & Tissue Kit （Qiagen）。提取方法如下：将25mg切成尽量小块置于1.5ml EP管中，加入180μl Buffer ATL及20μl Proteinase K，震荡混匀，56℃孵育1-3h至增生组织完全裂解，孵育期间间断震荡；震荡15s，加入200μl Buffer AL，震荡充分混合，加入200μl无水乙醇，再次充分震荡混匀；混合物转移至DNeasy Mini spin column，6,000×g（8,000 rpm）离心1min，弃废液；柱子中加入500μl Buffer AW1，6000×g（8000 rpm）离心1min，弃废液；柱子中加入500μl Buffer AW2，20,000×g（14,000 rpm）离心3min，弃废液；将珠子置于新的1.5ml或2ml离心管，在柱子的膜上加200μl Buffer AE，室温静置1min，≥6000×g（8000 rpm）离心1min。 小鼠尾部MmuPV1的PCR检测 将小鼠尾部增生组织置于PBS中，利用匀浆器高速匀浆3min。匀浆液10，000 rpm离心3min，将上清液转移到新1.5ml EP管中。配置反应体系，上下游引物分别为对MmuPV1 E2基因，MmuPV1_E2_1（5`- GCC CGA AGA CAA CAC CGC CAC G-3`）和MmuPV1_E2_2（5'-CCT CCG CCT CGT CCC CAA AAA ATG G-3'）。反应条件：95℃ 10min；95℃ 15s；60℃ 60s，68℃ 45s，40个循环；68℃ 10min。 小鼠尾部MmuPV1感染组织病理学检测 安乐小鼠，解剖采集尾部增生部位皮肤，进行苏木精-伊红（HE染色）。方法简述：组织块经10%的多聚甲醛固定、脱水透明后，置于熔化的石蜡中进行包埋，进而制作石蜡切片；切片脱蜡后进行HE染色；进一步的脱水透明，封片，显微镜下观察。 RNAscope原位杂交 安乐小鼠，解剖采集尾部增生部位皮肤置于10%多聚甲醛固定、脱水透明后，置于熔化的石蜡中进行包埋，进而制作石蜡切片，切片进行后续RNAscope原位杂交，具体实验步骤如下： （1）载玻片脱蜡：60℃烤片1h，二甲苯脱蜡2次，每次5min，100%酒精2次，每次1min，切片朝上放到吸水纸上，室温静置干燥5min； （2）双氧水靶标修复：切片滴加约5-8滴RNAscope®双氧水，室温孵育10min，蒸馏水清洗切片3-5次后，将载玻片浸没到煮沸的1×RNAscope®靶标修复液中放置15min，蒸馏水清洗3-5次，100%乙醇中清洗1次，室温静置干燥； （3）画疏水圈：使用ImmedgeTM疏水笔在样本周围化疏水圈2-4次； （4）将载玻片置于HybEZTM载玻片架中，滴加5滴RNAscope®蛋白酶plus，放入HybEZTM湿盒，放回40℃杂交炉 30min。蒸馏水洗3次； （5）探针杂交：载玻片滴加4滴E1^E4探针，再放入湿盒，杂交炉40℃孵育2h，将载玻片浸没于1×清洗缓冲液中，室温，每次2min； （6）杂交Amp1：载玻片上滴加4滴Amp1，放回湿盒，杂交炉杂交炉40℃孵育30min，将载玻片浸没于1×清洗缓冲液中，室温，每次2min； （7）杂交Amp2：载玻片上滴加4滴Amp2，放回湿盒，杂交炉杂交炉40℃孵育15min，将载玻片浸没于1×清洗缓冲液中，室温，每次2min； （8）杂交Amp3：载玻片上滴加4滴Amp3，放回湿盒，杂交炉杂交炉40℃孵育30min，将载玻片浸没于1×清洗缓冲液中，室温，每次2min； （9）杂交Amp4：载玻片上滴加4滴Amp4，放回湿盒，杂交炉杂交炉40℃孵育15min，将载玻片浸没于1×清洗缓冲液中，室温，每次2min； （10）杂交Amp5：载玻片上滴加4滴Amp5，放回湿盒，杂交炉杂交炉40℃孵育30min，将载玻片浸没于1×清洗缓冲液中，室温，每次2min； （11）杂交Amp6：载玻片上滴加4滴Amp6，放回湿盒，杂交炉杂交炉40℃孵育15min，将载玻片浸没于1×清洗缓冲液中，室温，每次2min； （12）信号检测：弃掉液体后，载玻片上滴加120μl DAB工作液，室温静置10min，去除DAB工作液，蒸馏水洗3-5次； （13）载玻片复染：载玻片放入苏木精染色液中，室温静置2min，蒸馏水洗3-5次，利用0.02%氨水洗一次，蒸馏水再洗3-5次； （14）载玻片脱水：载玻片放入70%乙醇，室温静置2min，100%酒精，室温静置2min，100%酒精，室温静置2min，二甲苯溶液，室温静置5min； （15）封片：载玻片风干后，滴加1滴Cytoseal封片剂，盖上盖玻片，风干载玻片5min。 转录组差异分析 TRIzol法提取尾部增生皮肤（实验组）及尾部正常皮肤（空白对照组）样本RNA，通过琼脂糖凝胶电泳分析RNA完整性及是否有DNA污染、Nanodrop进行RNA浓度和纯度检测。送到北京诺禾致源科技股份有限公司测序平台进行RNA测序。通过文库构建并测序获得原始测序序列后进行信息分析流程，主要由两个阶段：a）评估测序数据质量；b）信息挖掘及分析。将实验组与对照组RNA-seq序列进行对比，鉴定分析差异基因表达和聚类分析（包括差异基因数目统计、GO富集分析、KEGG通路富集分析），采用edgeR软件进行表达差异显著性分析。

结核病是由结核分枝杆菌（结核菌）引起的一种慢性传染性疾病，结核感染通常会累及肺、淋巴系统及其它多组织器官。除少数发病急促外，临床上多呈慢性过程。常有低热、乏力等全身症状和咳嗽、咯血等呼吸系统表现。感染后潜伏期4～8周，其中80%发生在肺部，其他部位（颈淋巴、脑膜、腹膜、肠、皮肤、骨骼）也可继发感染。

1.1实验材料  C57BL/6N 小鼠（北京维通利华，SCXK (京)-2016-0006），右旋糖酐铁注射液（江西创导动物保健品有限公司），血清铁、铁蛋白、转铁蛋白及可溶性转铁蛋白受体检测试剂盒（酶免公司），组织铁检测试剂盒（南京建成生物工程研究所），普鲁士蓝染色试剂盒（Solarbio），结核分枝杆菌标准株 H37Rv（菌号为 93009，本室保存），中性罗氏培养管（珠海贝索生物），BACTEC MGIT 7H9 98 分枝杆菌快速培养管（BD 公司）。 1.2 实验方法 1.2.1 铁过载小鼠模型建立  6~8 周龄 SPF 级雌性 C57BL/6N 小鼠随机分成阴性对照、低剂量、中剂量和高剂量 4 个小组，实验组分别腹腔注射右旋糖酐铁3.75、7.5、15 mg/次，阴性对照组小鼠腹腔注射等体积生理盐水，3 次/周，共计 4 周。定期观察小鼠生长及精神状态，称重并记录。动物实验经本所实验动物管理和使用委员会（IACUC）批准，批准号为：ZLJ2019001。 1.2.2 血清生化指标与组织铁含量测定   建模完成后将小鼠摘眼球采血，4 ℃凝结过夜，2000 g 4 ℃离心 10 min，分离小鼠血清并检测血清铁、铁蛋白、转铁蛋白及可溶性转铁蛋白受体含量。解剖取小鼠心脏，肝脏、脾脏、肺、肾脏及小肠等组织器官，称重后加 1ml 生理盐水充分研磨并裂解组织碎片，12000 g 4 ℃离心 20 min，取上清并测定蛋白浓度。 血清生化检测按试剂盒说明书进行，组织铁测定则按试剂盒测定方法计算相同蛋白浓度下各组织铁含量。 1.2.3 铁过载小鼠 Mtb 感染 SPF 级 C57BL/6N 随机分成空白对照组、空白 Mtb 感染组、中剂量铁过载模型组和中剂量铁过载模型 Mtb 感染组，每组 6 只。其中 Mtb 感染组小鼠经尾静脉注射对数生长期 H37Rv 单细胞菌悬液 100 μl（1×10 6 CFU/ml），空白对照组注射等剂量无菌生理盐水。本所 ABSL-3 实验室（国卫 ABSL3-059） 正常饲喂， 观察并记录小鼠临床表现，感染后 4 周解剖小鼠。 1.2.4 小鼠组织荷菌量测定 ABSL-3 实验室动物解刨台中解剖感染小鼠，无菌取小鼠肺、脾和肝脏组织；拍照记录肺、脾和肝脏等器官大体病变情况，取小鼠左肺、脾头及肝小叶于生物 安全柜内称重，依次经 2%稀硫酸溶液、生理盐水漂洗 30 s，1 ml 生理盐水温和 匀浆后进行 10倍倍比稀释，分别取 10-3，10-4和 10 -5 稀释液 50 µl 均匀涂布于中性罗氏培养管内，37℃培养 4 周，计算相应的组织器官荷菌量。另取 10 -1稀释液 500 μl 接种于 BD BACTEC MGIT 960 培养系统，通过记录报阳时间进行结核菌的快速检测。 1.2.5 组织切片 HE染色与铁染色 小鼠各组织器官，10%中性福尔马林溶液固定 48 h。组织按长轴最大横切面修块、梯度乙醇脱水、石蜡包埋并切成 5 µm 厚度切片，HE 染色后扫描载玻片并保存为 NanoZoomer 数字病理图像，不同视野下拍照并进行组织病理学分析。铁染色组织切片脱蜡至水，切片入 Perls 染液浸染 20 min，蒸馏水充分冲洗切片5 min，入核固红染色液，淡染细胞核 10 min，自来水冲洗 5 s。常规脱水透明，中性树胶封固，晾干后拍照观察其病理形态改变及铁沉积程度。 1.3 统计学分析   SPSS16.0 进行统计学处理，结果以平均数±标准差表示。不同实验处理组之间差异比较采用单因素方差分析，P ＜ 0.05 为差异有统计学意义。柱形图采用 GraphPad Prism 5 软件制作。

新型冠状病毒肺炎（Corona Virus Disease 2019，COVID-19），简称“新冠肺炎”，是指2019新型冠状病毒（2019-nCoV）感染导致的肺炎。老年人及有基础疾病者感染后病情较重。

实验材料     1.1  SARS-CoV-2（原2019-nCoV, HB-01），由中国疾控中心谭文杰教授提供。 1.2 实验动物 选用SPF级2-4岁雄性恒河猴，2.5-3.5kg，来自中国医学科学院医学实验动物研究所（IACUC 批准号：BLL20001） 实验环境 所有涉及的病毒实验操作全部在中国医学科学院医学实验动物研究所ABSL-3实验室完成，该实验室已经具备相关实验室和福利伦理资质。 病原培养鉴定 将新型冠状病毒接种到Vero细胞进行分离和储存。Vero细胞培养在DMEM（英潍捷基, 美国）添加10%胎牛血清，100 IU/ml 青霉素和100 μg/ml链霉素的培养基中，环境为37°C，5%CO2。新型冠状病毒的病毒滴度用标准的半数细胞感染率（a standard 50% tissue culture infection dose，TCID50）进行分析。 实验操作规程 （1） 感染途径：经气管感染； （2） 感染剂量：1×106 TCID50 只； （3） 感染体积：1ml/只； （4） 对照组：等体积 PBS。 4.3 动物模型分析 （1）症状观察：感染后，每天观察动物一般症状，记录体重和体温等。 （2）病毒载量：定时收集各组动物脏器，进行RNA抽提，利用RT-PCR技术，检测组织中病毒载量。RT-PCR所用的新型冠状病毒引物如下：上游为5’-TCGTTTCGGAAGAGACAGGT-3’ 下游为5’-GCGCAGTAAGGATGGCTAGT-3’。 （3）病毒分离：肺组织在 DMEM 溶液中研磨制备成匀浆，离心分离上清后，接种于Vero细胞分离病毒并观察细胞病变。 （4）影像学检查：感染后 0,3,5,7,9,11,13,15天做X-RAY检测。 （5）病理学观察 用新鲜的组织福尔马林固定，制备石蜡切片，用HE，免疫组化或荧光染色，镜下观察。 （6）免疫学检测：感染后第3，4，6，7，11，14天全血进行白细胞、淋巴细胞、单核细胞检查和CD3+,CD4+,CD8+,巨噬细胞，单核细胞，以及血清中特异性抗体。 4.4 数据统计处理方法 所有的数据用GraphPad Prism 6.0 软件分析，感染组小鼠和其他对照组小鼠用T 检验方法分析差异，显著性差异用*p ﹤ 0.05, **p﹤0.01 或者 #p﹤0.05, ##p﹤0.01 表示。