瘦素基因(Leptin)敲除大鼠

   背景品系为SD(Sprague Dawley, SD)大鼠 ，为大鼠（rat；rattus norregicus）的一个品系，属于动物界、脊索动物门、脊椎动物亚门、哺乳纲、啮齿目、鼠科、大家鼠属（Genus Rattus）、大家鼠种（Species rattus norvegicus）的动物，1925年，美国斯泼累格•多雷（Sprague Dawley）农场用Wistar大鼠培育而成。

利用TALENs和显微注射技术,获得一只在Leptin编码区418- 425位碱基缺失的大鼠，由于同时产生了TGA终止密码子(图1b)，导致该蛋白C末端缺失了28个氨基酸。

       图1, western blot检测Leptin+/+大鼠和Leptin-/-大鼠肝脏中leptin的表达。

5.1  Leptin敲除大鼠表现肥胖表型

从出生后1月龄始, Leptin敲除大鼠比野生大鼠表现出现显著的体重增加，1月龄Leptin-/-雌、雄鼠体重比同窝大鼠（Leptin+/+）分别增加了27%和37%，到3月龄时Leptin-/-雌、雄鼠体重比同窝大鼠（Leptin+/+）增加了38%和39%，6月龄、8月龄时Leptin-/-雌鼠体重是同窝大鼠（Leptin+/+）的2.3倍，6月龄、8月龄时Leptin-/-雄鼠的体重是同窝大鼠（Leptin+/+）的1.8倍和2.0倍(见图1C和图1D)。MRI结果也观察到Leptin-/-大鼠皮下和腹腔脂肪积累的增加（图1B）。麻醉处死4月龄大鼠，剥离皮下及腹腔脂肪并称重，证实Leptin-/-大鼠的皮下和腹腔脂肪的重量分别是Leptin+/+大鼠的20倍和4倍。

图2  Leptin敲除(Leptin-/-)大鼠表现肥胖。

A：6月龄Leptin+/+大鼠（左）和Leptin-/-大鼠（右）。 B，Leptin-/-大鼠MRI分析,白色部分为高反射的脂肪组织。C：1-8月龄的雌性Leptin+/+（n=5）及Leptin-/- 大鼠（n=5）的体重变化。D：1-8月龄的雄性Leptin+/+（n=4）及Leptin-/- 大鼠（n=2）的体重变化。*，p<0.05。

5.2  Leptin敲除大鼠肝脏中大量脂肪沉积

取材4、8月龄雌性Leptin-/-大鼠及Leptin+/+大鼠肝脏固定，石蜡包埋及切片，HE染色观察结果显示，4月龄 Leptin-/-大鼠与Leptin+/+大鼠相比，没有明显的病理变化，8月龄 Leptin-/-大鼠肝脏肝小叶中出现大量脂肪空泡，提示肝细胞脂肪变性。

图3 Leptin-/-大鼠肝脏组织脂肪变性（40×）。

4M,4月龄雌性Leptin-/-大鼠（n=2）及Leptin+/+大鼠（n=2）；8M，8月龄雌性Leptin-/-大鼠（n=2）及Leptin+/+大鼠（n=2）。

5.3  雌性Leptin敲除大鼠空腹血糖升高

比较出生后1月龄至8月龄，Leptin+/+雌鼠和Leptin-/-雌鼠的空腹血糖值（见图2）。雌鼠自1月龄起，Leptin-/-大鼠的空腹血糖值就显著高于Leptin+/+大鼠（40%），3月龄比Leptin+/+大鼠高33%，6月龄血糖降低但仍然比Leptin+/+大鼠高26%，8月龄时比野生大鼠高出11%，高血糖表型可以维持5个月以上。雄性Leptin+/+大鼠和Leptin-/-大鼠的空腹血糖值没有显著差异。

图4 Leptin-/-基因敲除大鼠空腹血糖受损。

1,3,6,8月龄的雌性Leptin-/-大鼠（n=5）及Leptin+/+大鼠（n=5）的空腹血糖变化。*，p<0.05。

5.4  Leptin敲除大鼠出现明显的胰岛素抵抗

4月龄时，对Leptin-/-大鼠进行糖耐受实验(图4a)和胰岛素耐受实验(图4b)，测定结果显示4月龄的Leptin-/-大鼠就出现了明显的高胰岛素血症及胰岛素抵抗的症状。

图5，4月龄Leptin-/-大鼠的糖耐受曲线和葡萄糖刺激下的胰岛素曲线

Leptin-/-大鼠和Leptin+/+的腹腔糖耐受曲线(n=5)；b，葡萄糖刺激下的胰岛素曲线(n=5)；

5.5  Leptin敲除大鼠胰岛增生

取材4、8月龄雌性Leptin-/-大鼠及Leptin+/+大鼠的胰腺组织固定，石蜡包埋及切片，H&E染色观察基因敲除大鼠胰腺病理学变化（见图4）。结果显示，6月龄 Leptin-/-大鼠与Leptin+/+大鼠相比，胰岛体积增大，但是数量增多不明显，且胰腺也没有脂肪细胞浸润，而8月龄Leptin-/-大鼠胰岛数量明显增多，体积增大更显著，胰腺内较多脂肪细胞浸润，胰岛形态由于快速扩张而极不规则。胰岛素抗体免疫组化显示，4、8月龄Leptin-/-大鼠β细胞增多，胰岛素分泌大大增加（见图5）。

图6 Leptin-/- 大鼠胰腺组织胰岛病理学观察。

4M,4月龄雌性Leptin-/-大鼠（n=2）及Leptin+/+大鼠（n=2）；8M，8月龄雌性Leptin-/-大鼠（n=2）及Leptin+/+大鼠（n=2）。