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标识符 CSTR:16397.09.0G01001254
资源中文名称 CTLA4人源化小鼠模型
资源英文名称 CTLA4 humanized mouse model
疾病概述 在正常的免疫过程中,T细胞的有效激活是其能发挥免疫效应的前提及保证,若T细胞的活化不完全或者处于免疫应答无能状态时,则不能发挥杀灭肿瘤细胞的作用。T细胞的活化需要双信号同时刺激,即第一信号和第二信号的协同作用。第一信号来自于APC细胞表面的抗原肽-MHC复合物和T细胞表面的相对应受体相结合所传导,第二信号来自于APC细胞表面的共刺激分子与T细胞表面的相对应受体相结合所传导。 目前已经知道的最主要的共刺激分子是B7-1和B7-2,他们所对应T细胞表面受体为CD28,他们结合传递的是刺激性第二信号,和第一信号协同刺激T细胞的活化。近年来的研究发现,CTLA4与CD28会竞争性的与B7蛋白家族相结合,并且CTLA4与B7蛋白结合的亲和力是CD28的二十多倍,他们结合后在免疫反应的前期阶段传递抑制性信号,导致T细胞的活化受到抑制。免疫检验点CTLA4相当于是机体进化出来的刹车机制,它在维持免疫内稳态及防止免疫系统用力过猛之间发挥着重要作用,肿瘤细胞可以通过激活CTLA4信号通路从而躲避机体的抗肿瘤免疫效应。
实验动物背景信息

c57bl/6小鼠也被称为c57 black 6,1921年被培育出来,属于近交品系。该品系的最主要的两个特点就是品系稳定和易于繁殖。另外c57bl/6小鼠是第一个完成基因组测序的小鼠品系。

模型制作方法

利用CRISPR /Cas9 技术,建立CTLA4基因人源化小鼠模型,利用PCR、RT-PCR和Western Blot 的方法进行鉴定及分析。

模型表型数据

1 CTLA4人源化小鼠模型的建立

将F0代小鼠与C57小鼠进行杂交,获得杂合子hCTLA4 h/m,将杂合子互交并将子代进行基因型鉴定(图2),得到纯合敲入小鼠hCTLA4 h/h。

注:使用PCR鉴定子代小鼠基因型,突变可传代。M:Marker(TaKaRa,DL2000);H: 水。h/h:CTLA4人源化纯合子小鼠;h/m:ctla4人源化杂合子小鼠;m/m:野生型小鼠。

图2 PCR鉴定子代小鼠基因型

2 CTLA4人源化小鼠组织中蛋白及mRNA表达

为了鉴定转基因小鼠是否在蛋白水平发生CTLA4人源化,取1-2月龄小鼠脾、肺进行Western Blot,分别使用种属反应性为小鼠、大鼠和人,以及种属反应性为人的CTLA4抗体检测蛋白表达(图3a)。结果显示,市售的种属反应性为人的CTLA4抗体无法区分人源与鼠源的蛋白。

因为市售蛋白抗体无法区分人源与小鼠源CTLA4蛋白,使用RT-PCR鉴定人源化小鼠脾细胞(CD3抗体刺激4天)中mRNA表达(图3b)。结果可见人特异性引物(hCTLA4-F: 5’CCCTGCACTCTCCTGTTTTTTCT,hCTLA4-R: 5’TTGATTTCCACTGGAGGTGCC)只能扩增纯合子hCTLA4 h/h的cDNA,而小鼠特异性引物(mCTLA4-F: 5’CCTTTTGTAGCCCTGCTCACT, mCTLA4-R: 5’TTCACTCTGCTTTCATTAAAGGTAC。)也只能扩增hCTLA4 m/m的cDNA,可见ctla4人源化转基因小鼠中只表达人源CTLA4的mRNA。

注:m/m:野生型小鼠;h/h:CTLA4人源化纯合子小鼠。a:Western Blot 检测CTLA4蛋白在脾和肺中的表达,CTLA4:种属反应性为小鼠、大鼠和人的CTLA4抗体,;hCTLA4:种属反应性为人的CTLA4抗体。b:RT-PCR检测CTLA4 mRNA在脾中的表达,

图3CTLA4在人源化小鼠中的蛋白及mRNA表达

3 人源CTLA4基因可正常替代小鼠CTLA4基因

文献报道,CTLA4基因敲除小鼠会由于严重的自身免疫疾病,在出生后3-4周内死亡。但在CTLA4人源化小鼠中,没有观察等到淋巴细胞的浸润,并且根据我们的观察结果表明,纯合的CTLA4人源化小鼠寿命正常,在10个月内没有观察到自身免疫性疾病发展的迹象。因此,在纯合的CTLA4人源化小鼠中,人源CTLA4等位基因已功能性替代了小鼠CTLA4基因。

4 人源化CTLA4基因小鼠免疫系统正常。

我们利用流式细胞术检测了野生型小鼠和人源化CTLA4基因小鼠外周血中各类细胞的比例,发现其外周血中B细胞(B220+)、T细胞(CD3+、CD4+、CD8+)、粒细胞(CD11b)和NK细胞的比例都没有明显差异。同时检测骨髓、脾脏和胸腺等免疫器官中免疫细胞的比例发现人源化CTLA4基因的小鼠和野生小鼠相比没有差异。结果说明人源化CTLA4基因后没有改变正常生理状态下小鼠免疫系统的组成(图5)。

注:m/m:野生型小鼠;h/h:CTLA4人源化纯合子小鼠。a:流式细胞术统计不同免疫细胞在外周血中的比例。B-E:流式细胞术检测不同免疫细胞的直方图。

图4 CTLA4在人源化小鼠外周血中不同免疫细胞的比例

动物模型的评价与验证

1基因型鉴定

   在基因水平鉴定,可以检测到纯合小鼠。

2 该基因在敲除组织部位的蛋白表达水平

  对人源化小鼠组织取材,在白细胞中,通过反转录PCR只检测到人源CTLA4基因的表达。

3生长发育和生存率情况

  该基因人源化小鼠寿命正常,组织器官中未观察等到淋巴细胞的浸润,在出生后10个月内没有观察到自身免疫性疾病发展的迹象,也未观察到生长情况异常。

    4 CTLA4人源化小鼠中,CTLA4单克隆抗体伊匹木减缓肿瘤生长速度

目前批准用于临床的抗CTLA4抗体可以与人源CTLA4结合,但不会与鼠源CTLA4交叉反应[11]。为了检测建立的CTLA4h/h小鼠是否可以用于临床药物筛选,我们比较了CTLA4单克隆抗体伊匹木(Ipilimumab)在CTLA4h/h 和CTLA4m/m小鼠中抑制肿瘤生长的能力。用黑色素瘤细胞系B16分别移植入CTLA4h/h 和CTLA4m/m小鼠,在移植后第3、5、7天,伊匹木单抗以100μg/只的剂量进行3次腹腔注射,观察肿瘤生长至14天。在CTLA4h/h小鼠中,伊匹木单抗减缓肿瘤生长速度(图6a,b),在第14天时,CTLA4h/h小鼠中肿瘤质量低于CTLA4m/m小鼠(图6c,d)。结果显示,伊匹木单抗可以在我们建立的CTLA4h/h小鼠中发挥有效作用。

注:向CTLA4h/h(左腋下)和CTLA4m/m小鼠(右腋下)皮下注射5×105 B16黑色素瘤细胞,并在第3、5、7天(如箭头所示),腹腔注射依匹木单抗100μg/只,观察并测量肿瘤直径至细胞移植后14天(a,b)。在细胞移植后14天时取出肿瘤称重(c,d)。数据表示平均值±标准误,每组6–8只小鼠。使用单因素方差分析(Dunnett’s test)进行统计。*P < 0.05, **P < 0.01。

图5在CTLA4h/h小鼠中,伊匹木减缓B16黑色素瘤生长速度

保存方式 冷冻
合作方式 仅限合作研究
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