实验用狨猴，3-4 岁，雄性，遗传背景明确。按照国家微生物和寄生虫SPF等级通过检测，抗MERS抗体阴性。绒猴在生物安全三级（BSL-3）实验室内饲养，并按国家动物生物安全标准操作规程进行操作。

MERS-CoV (hCoV-EMC，GenBank: MH454272.1）由荷兰伊拉斯姆斯大学医学中心Ron Fouchier 教授馈赠。采用支气管镜辅助攻毒，攻毒剂量为

6.5×10⁶TCID₅₀/1ml/只。

观察攻毒后绒猴临床症状，每天两次。分别于攻毒前1d和攻毒后3d进行胸部X光拍摄。攻毒后随时观察狨猴状态，一旦评分超过35 分，即进行人道主义安乐死。采集肺、气管、心、脾、肾、脑、肝脏、肠组织进行病理、免疫组化和病毒检测。攻毒后分别在1, 3 天采集咽拭子、鼻拭子、肛拭子进行病毒检测。

MERS-CoV感染绒猴临床观察

狨猴经气管插管辅助攻毒后，狨猴表现了明显的感染症状，引起了中度或重度的呼吸道症状，甚至出现死亡。主要表现为呼吸频率增加，活动减少，身体蜷缩，饮食量减少，体重降低。特别是攻毒组有两只狨猴症状更明显。攻毒后3天内狨猴体温下降，白细胞数减少，红细胞数变化不明显。对照组狨猴无任何临床（图1）。

2、MERS-CoV感染绒猴病理学检查

MERS-CoV感染前和感染后1天和3天分别进行了肺部X光拍摄，感染前肺部并未观察到任何变化，感染1天时肺右下出现阴影，表明肺部有炎症反应。3天时阴影面积有所增大（图2A）。感染3天时，对剩余的1只攻毒狨猴进行了CT拍摄，发现了肺部出现片状低密度影，跟X光拍摄结果类似（图2B）。攻毒两天后，1只狨猴死亡，一只执行安乐死，大体解剖可见肺部有大面积充血呈暗红色。剩余1只狨猴于感染后3d执行安乐死，大体解剖亦可见肺部有不同程度充血呈暗红色，其位置跟X光和CT检查结果一致（图2C）。而对照组肺部无明显变化。显微病理检查可见攻毒组狨猴各个肺叶均发生多灶性到融合性渗出性肺炎，肺泡中可见大量渗出的炎性细胞（巨噬细胞、嗜中性粒细胞和淋巴细胞为主）和纤维素，并发生肺水肿，局灶肺泡隔显著增宽，肺泡结构消失，血管扩张充血，周围可见大量炎性细胞浸润，出血（图3）。另外肾脏肾小球毛细血管扩张充血，少量肾小管上皮细胞不同程度变性坏死，有的管腔中可见蛋白管型形成（图3）。而对照组无此变化。其它组织未见明显的病理改变。免疫组化分析表明攻毒组狨猴肺和气管中可检测到病毒蛋白的表达，阳性细胞主要分布在Ⅰ型肺泡细胞和巨噬细胞。肺外器官并未检测到病毒蛋白的存在。对照组猴肺中并未检测到病毒特异蛋白的存在（图4）。

图2 狨猴胸透图（A）、CT（B）和肺大体解剖图(C)

图3  MERS-CoV攻毒后狨猴病理变化

(A-F：感染组狨猴肺组织弥漫性间质性肺炎，G-I：气管上皮细胞损伤，J-L：肾小管上皮细胞不同程度变性坏死，M-O：脾脏无病理损伤)

图4 MERS-CoV攻毒后绒猴免疫组化

（A-F：狨猴肺组织免疫组化，G-I：狨猴气管免疫组化。黑色箭头表示病原分布。）

3、qRT-PCR方法检测拭子和组织样品病毒载量

攻毒后分别对拭子样品和组织样品进行病毒核酸检测，结果发现攻毒组3只狨猴均可在肺部和气管检测到病毒核酸存在。攻毒两天后死亡的两只狨猴还在心脏、肝脏、脾脏和肾脏检测到病毒核酸的存在，表明存在病毒血症的可能性。而另一只狨猴并未在肺外组织检测到病毒核酸的存在。采集的拭子样品进行病毒核酸检测，结果显示在攻毒狨猴的肛拭子中均未检测到病毒核酸。死亡的2只狨猴均可在攻毒1天时的咽拭子中检测到病毒，但其中仅有一只在鼻拭子中检测到病毒核酸。攻毒组另外1只狨猴在鼻拭子和肛拭子并未检测到病毒核酸。对照组狨猴组织和拭子样品未检测到病毒核酸的存在（表1）。

表1 组织和拭子样品中病毒核酸检测

″-″ Virus was not detected in the samples.

ND,  not done.

4、 拭子和组织样品中病毒滴度测定

对采集的鼻拭子、咽拭子、肛拭子在Vero细胞上进行病毒滴度测定，仅有1只狨猴在攻毒1天时的咽拭子中检测到病毒，滴度可达10³TCID₅₀/ml，该狨猴在攻毒两天后死亡。其它拭子样品并未分离到病毒。采集的组织样品进行病毒分离，只在肺部和气管分离到较高滴度的病毒。其他器官（肾脏、心脏、肝脏、脾脏）并未分离到病毒（图5）。对照组狨猴拭子和组织样品也未分离到病毒。

图5 MERS-CoV 攻毒后狨猴各组织分毒情况

5、狨猴肺部电镜观察

对感染MERS-CoV病毒的肺组织进行透射电镜观察，结果发现在其胞浆中可观察到病毒颗粒（图6），进一步证实病毒可在肺细胞中复制。

图6 感染MERS-CoV 的狨猴肺细胞的超微病理观察