实验用恒河猴在实验室内传代三次以上，遗传背景明确，年龄为1-3岁。实验前进行血清学检查证明抗MERS抗体阴性。恒河猴在生物安全三级（BSL-3）实验室内饲养，并按国家动物生物安全标准操作规程进行操作。

MERS-CoV (hCoV-EMC，GenBank: MH454272.1）由荷兰伊拉斯姆斯大学医学中心Ron Fouchier 教授馈赠。采用支气管镜辅助攻毒，攻毒剂量为6.5×10⁷TCID₅₀/1ml/只。

观察攻毒后恒河猴临床症状，每天两次。分别于攻毒前1d和攻毒后3d、5d

进行肺部X光拍摄。攻毒后3天，MERS-CoV攻毒组安乐死2只恒河猴，对照组安乐死1只，采集肺、气管、心、脾、肾、脑、肝脏、肠组织进行病理、免疫组化和病毒检测。攻毒后分别在1, 3, 5, 7, 9, 11, 14, 21和28天采集咽拭子、鼻拭子、肛拭子进行病毒检测。并且在攻毒后7, 14, 21和28天采集血液分离血清，进行中和抗体检测。

MERS-CoV 感染恒河猴临床观察

MERS-CoV攻毒后，恒河猴表现了一定的感染症状，主要表现为攻毒后体温出现瞬时升高，即感染后1天、2天体温急剧上升，但3天时恢复正常（图1）。并且恒河猴在攻毒后饮水量减少，整个实验期内恒河猴体重并未有明显的变化，也没出现死亡现象。对攻毒后恒河猴进行了血常规检测，发现攻毒后1天，白细胞有瞬时升高，但3天时就恢复正常。另外还进行了肝功能和肾功能检测，结果发

图1 恒河猴MERS-CoV攻毒后临床症状变化

2、MERS-CoV感染恒河猴病理学检查

MERS-CoV感染前和感染后3天和5天分别进行了肺部X光拍摄，感染前肺部并未观察到任何变化，感染3天时肺右下出现阴影，表明肺部有炎症反应。5天时阴影面积有所减小，但仍存在（图2A）。MERS-CoV感染后3天，大体解剖可见恒河猴肺部有不同程度充血呈暗红色，其位置跟X光检查结果一致（图2B）。而对照组肺部无明显变化。显微病理检查可见攻毒组恒河猴出现间质性肺炎，表现为肺泡隔中度到重度增宽，以支气管为中心发生灶状实变，其中大量的炎性细胞浸润，以淋巴细胞、巨噬细胞为主，少量嗜中性粒细胞和浆细胞；血管淤血，伴有出血；支气管管腔中可见少量渗出和红细胞，而对照组无此变化（图3）。肺外其它组织未见明显的病理改变。免疫组化分析表明攻毒组恒河猴肺和气管中可检测到病毒蛋白的表达，阳性细胞主要分布在Ⅰ型、Ⅱ型肺泡细胞和巨噬细胞。肺外器官并未检测到病毒蛋白的存在。对照组猴肺中并未检测到病毒特异蛋白的存在（图4）。

图3 MERS-CoV攻毒后恒河猴病理变化

(A-B：感染组恒河猴肺组织，E：感染组恒河猴气管组织，G：感染组恒河猴肾组织

C-D：正常组恒河猴肺组织，F：正常组恒河猴气管组织，H：正常组恒河猴肾组织）

图4 MERS-CoV 攻毒后恒河猴免疫病理检测

（A-C：恒河猴肺组织免疫组化图，D-F：恒河猴气管免疫组化图）

3、qRT-PCR方法检测拭子和组织样品病毒载量

攻毒后分别对拭子样品和组织样品进行病毒核酸检测，结果发现攻毒后仅在肺部和气管检测到高的病毒载量，特别是攻毒后1天时，咽拭子也检测到了较高的病毒载量。而在其它组织和其它时间点拭子检测不到病毒核酸或很低的病毒载量存在。对照组恒河猴组织和拭子样品未检测到病毒核酸的存在（图5）。

图5 恒河猴肺组织和拭子病毒核酸载量检测

4、 拭子和组织样品中病毒滴度测定

对采集的鼻拭子、咽拭子、肛拭子在Vero细胞上进行病毒滴度测定，并未分离到病毒，与PCR检测检测结果一致。攻毒后3天，采集的组织样品也进行病毒分离，只在肺部和气管分离到病毒，肺部病毒滴度达10^1.67 TCID₅₀/ml，气管病毒滴度达10^1.5 TCID₅₀/ml。其他器官（肾脏、大脑、心脏、肝脏、脾脏和肠）并未分离到病毒。对照组恒河猴拭子和组织样品均未分离到病毒。

5、 MERS-CoV 感染后血清中和抗体检测

攻毒后7天、14天、21天和28天，采集感染组和对照组恒河猴血液，分离血清进行中和抗体检测。微量中和试验结果显示感染组恒河猴在攻毒后7d即可检测到中和抗体的存在，在感染后14d时达到高峰，可达1：320，之后抗体滴度稍微有所下降，在攻毒后28d时达到1：160。对照组血清中检测不到中和抗体的存在（图6）。