东方土拨鼠

WHV为cWHV7P1毒株（NCBI存储号:M18752.1），来自美国乔治敦大学微生物与免疫室，采集来自慢性感染土拨鼠的血清，病毒储存液浓度为1×10¹⁰ 拷贝/ml。

7日龄-1月龄土拨鼠。实验前进行血清病毒WHV DNA 的PCR检查，阴性土拨鼠方可入组。

3、感染实验

动物经兽用氯胺酮麻醉后，经颈外静脉注射WHV，感染剂量分别为5×10⁶ WID₅₀（低剂量）和1×10⁷ WID₅₀（高剂量），感染体积为100 μl，病毒储存液用生理盐水稀释，对照组土拨鼠注射等体积的生理盐水，感染后的土拨鼠隔离饲养。在感染后不同时间点，动物经兽用氯胺酮麻醉后，心脏取血，离心分离血清。

感染后血清标志物检测：土拨鼠肝炎病毒表面抗原（WHsAg）和核心抗原（WHcAg）经过大肠杆菌原核表达系统表达，经镍离子亲和层析纯化。WHsAg分别免疫兔和鸡后获得兔抗WHsAg抗体和鸡抗WHsAg抗体。通过ELISA双抗夹心法检测WHsAg，ELISA直接法检测WHcAb。

5、核酸检测

使用DNA提取试剂盒QIAamp MinElute Virus Spin Kit从50 μl血清中抽提 WHV DNA。利用实时荧光定量PCR测定血清中WHV DNA拷贝数，引物为WHVSF1\WHVSR1(5’-GGCAACAACATAAAAGTCAC-3’\5’-AACTAAACCACGTGGTATGTC-3’)，梯度稀释的WHV DNA质粒做标准品。

取血样检测感染后土拨鼠肝功能酶：丙氨酸转氨酶(ALT)和天门冬氨酸转氨酶(AST)。

甲醛固定的土拨鼠肝脏组织经石蜡包埋，常规病理组织切片处理后，HE染色，显微镜下观察病理改变。

肝脏病变组织经过组织修块，石蜡包埋后，切片厚度为4μm，经脱蜡水化，抗原修复，滴加20%正常山羊抗血清室温封闭后，滴加兔抗WHsAg抗体，稀释比例1:500,4度过夜。次日PBS洗涤，滴加荧光标记二抗，稀释比例1:5 000，PBS洗涤后，DAB显色，脱水封片，镜下观察。

土拨鼠感染WHV后第8周，血清中病毒载量达到最高峰（10⁶拷贝/ml，图1），血清中WHsAg浓度与病毒载量相对应，在感染后8周达到最高值（图2A），感染后血清中WHcAb自第2周开始检出，且浓度不断升高，低剂量组的WHcAb浓度在第8周达到最高峰，而高剂量组则持续增高（图2B）。在此期间，土拨鼠的肝功酶活性维持在较高水平：ALT和AST分别达到正常值的4～8倍和3～4倍（图3）。自感染后至16周，病毒复制、血清学指标和肝功能均处于较高水平，表明WHV感染的土拨鼠在此阶段处于急性肝炎期。急性肝炎期的病理表现为：汇管区肝细胞出现点灶状肝细胞坏死伴炎细胞浸润及散在出血（图4A、4B），免疫组化染色显示肝细胞胞浆出现大量的WHsAg染色颗粒 (图4C、4D)。

图1土拨鼠血清中病毒载量（lg 拷贝/ml）

感染后16周至24周，低剂量组土拨鼠血清中病毒DNA逐渐降低并消失（图1），与此相对应，其血清中WHsAg也渐趋于消失（图2A），而WHcAb则维持在较低水平（图2B）。同时，低剂量组土拨鼠的肝功酶ALT和AST也逐渐降低到感染前水平（图3），这些结果表明：低剂量组感染土拨鼠已由急性感染转为自愈。与低剂量组相反，高剂量组土拨鼠血清中病毒载量一直处于较高水平，截止到检测之日（第24周），病毒DNA拷贝数一直维持在10⁵拷贝/ml左右（图1）。与急性期相比，血清中WHsAg浓度略有下降（图2A），但WHcAb浓度则不断增高（图2B），同时，肝功酶ALT和AST的水平呈下降趋势，但仍为正常值的1倍左右（图3）。该结果表明：高剂量组土拨鼠仍维持低水平感染，提示向慢性肝炎的转变。

图2A 土拨鼠血清中表面抗原检测 (OD450)

图2B土拨鼠血清中核心抗体检测结果(OD450)

图3A  土拨鼠血清肝功酶AST检测结果（U/L）

图3B　土拨鼠血清肝功酶ALT检测结果（U/L）

  图4  低剂量组16周肝脏病理变化。注：A、C为对照组肝脏HE染色和免疫组化WHsAg染色结果。B 为低剂量组感染后第16周肝脏组织HE染色，D为WHsAg免疫组化染色