菌株准备

　　结核分枝杆菌标准株H37Rv或耐药株（内部编号94789）经小鼠体内两次增毒，于罗氏斜面培养基培养，收获斜面培养3周的细菌经5μm无菌滤器( Millipore公司)制成单细胞菌悬液，经罗氏斜面培养基培养计数，单细胞悬液菌浓度为1× 10⁷ CFU /ml，单细胞悬液分装冻存于－80℃低温冰箱备用。

动物的选择

　　中缅树鼩，1年龄，雄性，清洁级，体重100-170g，购自中国科学院昆明动物研究所。实验动物的使用得到了北京协和医学院中国医学科学院医学实验动物研究所实验动物使用和管理委员会的批准（批准号ILAC-PC-2012-003），动物在感染前一周进入医学实验动物研究所生物安全3级实验室。

动物分组与感染

　　取树鼩固定于保定袋中，暴露股静脉，75%酒精擦拭消毒，静脉注射250μl结核分枝杆菌H37Rv单细胞悬液，感染剂量为2.5× 10⁶ CFU（高剂量组），将H37Rv单细胞悬液稀释1000倍，再静脉注射250μl，感染剂量为2.5× 10³ CFU（低剂量组），高低剂量组各感染树鼩10只，4只为正常对照组，股静脉注射同等体积的生理盐水，所有实验均在医学实验动物研究所生物安全3级实验室（BSL-3）进行操作。

样本采集

　　攻毒后每天观察树鼩活跃度，用红外线体温计监测树鼩体温，每周称量一次体重。

　　感染后5W高剂量组取4只（其中一只病重死亡，死亡后及时解剖），低剂量组取4只，正常对照组取4只，8W高、低剂量组各取3只，11W高剂量组取3只，低剂量组取3只腹腔注射2%戊巴比妥钠（剂量为40mg/Kg）麻醉后心脏采血处死；1.6ml血液放置血沉管中，轻柔颠倒混匀数次，垂直静置血沉架上30分钟后读取1小时血沉值，约1.5ml血液放置血常规管，轻柔颠倒混匀数次，用动物血细胞分析仪检测血常规； 无菌取各组织，先后经过生理盐水、4%硫酸和生理盐水漂洗，进行组织病理分析、荷菌量检测、蛋白质谱分析和部分差异蛋白转录水平的分析。

组织病理分析

　　将采集后的各组织用4%中性甲醛固定一周后，常规方法切片、HE染色，光学显微镜观察病理组织学变化。

组织荷菌量检测

　　无菌取各组织约50mg，漂洗后加1ml生理盐水用玻璃组织研磨器研磨，组织悬液经无菌生理盐水按照1：10稀释后取0.1ml接种罗氏斜面培养基，平行接种3管。以上2个浓度均置于37℃，5%CO2培养箱中培养4周后进行菌落计数。

组织切片抗酸染色

　　病理组织片按常规方法脱蜡后染色，将脱蜡后的组织切片置于湿盒内，滴上抗酸初染液，90℃水浴5分钟后用细流水倾斜冲洗玻片至初染液洗掉后再滴上复染液脱色复染，直至玻片上的组织呈淡蓝色；镜检。

蛋白质谱分析

　　将高剂量组、低剂量组、正常对照组三组肺组织样品于沸水中5分钟灭活结核分枝杆菌。送公司进行蛋白样品的裂解、浓度测定， 蛋白酶解后用iTRAQ标记各组肽段混合，用SCX柱进行液相分离。基于Triple TOF 5600进行LC-ESI-MS/MS质谱分析。基于NCBI树鼩核酸序列数据库（50461 sequences），利用蛋白质鉴定软件Mascot 2.3.02进行检索，选择已经建好的数据库，进行数据库的搜索，并对质谱质量进行评估。获得的数据进行蛋白质生物信息学分析，包括差异蛋白的筛选，进行GO、COG注释，差异蛋白Gene Ontology富集分析、pathway富集分析，以及多样品间表达模式聚类分析。随机选取部分差异蛋白，用SYBR-Green的荧光定量PCR进行转录水平的分子验证。即从ITRAQ筛选的差异表达基因中选择一部分与结核感染相关的基因进行qRT-PCR验证。

树鼩模型的各指标的检测

3.1体温、体重、活跃度、血液学变化

　　各组体温无明显改变，低剂量组各时间段体重变化无明显规律，活跃度改变不明显，高剂量组1只感染后第五周病重死亡，体重降低51.52g，1只感染后八周活跃度明显降低，体重下降40.74g，余体重变化无明显规律，活跃度改变不明显。

　　血常规检查：高、低剂量组间血常规无明显变化，两组红细胞计数、血小板计数、血红蛋白含量无明显变化，白细胞总数升高，淋巴细胞比例多数增高。各组血沉均<5mm/h。

3.2 组织荷菌量

　　组织匀浆细菌培养高、低剂量组间无显著性差异，各组可见肺、肝、脾、肾、唾液腺、回肠、生殖器均有结核分枝杆菌菌落生长。

3.3组织切片抗酸染色

　　如图3.2所示，肺、脾、肝脏、肾上腺、肾、皮下组织和肌肉以及小脑镜下均可见红色抗酸染色阳性的杆菌。

3.4病理改变

3.4.1大体病理改变

　　如图3.1所示，感染后五周高剂量组病重死亡一只，体型明显消瘦，死亡后及时解剖,胃肠组织有自溶现象，皮下、肋间隙、膈肌、后腹膜可见1-5mm大小不一的结节，肾脏肉眼可见灰白色病灶。高剂量组感染后5W、8W共有4只，低剂量组感染后8W1只静脉注射部位有皮肤溃疡。2只高剂量组感染后8W、11W胸腔积液约1ml，1只高剂量组感染后11W头部皮下有脓肿。高剂量组各时间段肺组织肉眼均可见结节状病灶。

3.4.2组织病理改变

　　低剂量组各时间段组织病理无特异性改变。

　　如图3.2所示，高剂量组感染后5W病重死亡的一只脾脏内可见肉芽肿,周围炎细胞浸润；肝脏内炎细胞浸润；左肺及右肺可见多个界限清楚的实变灶，中央坏死，周围炎细胞浸润；肾间质内灶性炎细胞浸润；肾上腺灶性坏死，炎细胞浸润，被膜炎细胞浸润；真皮及皮下组织灶性坏死，炎细胞浸润；肌肉组织灶性坏死，炎细胞浸润（脓肿形成）；感染后5W其余动物肺组织未见特异性改变。感染后8W、11W肺组织可见大面积坏死，可见结节，结节中央坏死，周围大量炎细胞浸润。各时间段可见肝脏内小灶性炎细胞浸润，肾组织内灶性炎细胞浸润。出现皮肤溃疡的动物，取溃疡皮肤病检，可见真皮及皮下组织出血坏死，炎细胞浸润，肌肉组织大片坏死，炎细胞浸润。感染后8W活动度明显减少的动物，除上述肺组织特异性的改变，另可见小脑组织灶性坏死，周围少量炎细胞浸润。

3.5蛋白质谱

　　为了分析结核分枝杆菌感染树鼩肺组织中蛋白质表达变化，分别取高、低剂量组感染的树鼩肺组织和正常对照组的肺组织，利用蛋白裂解液裂解后，通过iTRAQ定量质谱方法分析差异蛋白，在相对定量时，如果同一个蛋白质的量在两个样品间没有显著的变化，那么其蛋白质丰度比接近于1。当蛋白的丰度比即差异倍数达到1.5倍以上或小于0.67倍，且经统计检验其P-value值小于0.05时，视该蛋白为不同样品间的差异蛋白。高剂量组（TH-A）与低剂量组（TH-B）相比筛选到的上调蛋白和下调蛋白分别为144和76个；高剂量组（TH-A）与正常对照组（TH-C）相比筛选到的上调蛋白和下调蛋白分别为134和53个；低剂量组（TH-B）与正常对照组（TH-C）相比筛选到的上调蛋白和下调蛋白分别为9和20个。高剂量组的部分表达上调的差异蛋白可能与结核感染相关，而在人类中，这些蛋白已证实与结核感染密切相关，如表3.1所示。将差异蛋白在KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）数据库中进行比对，以人类相关蛋白为对照，差异蛋白参与的信号通路如下：肌动蛋白细胞骨架、吞噬、钙离子信号通路、Jak-STAT信号通路、抗原加工及呈递、CD45/MAPK信号通路、自噬通路，这些信号通路都与结核分枝杆菌感染相关，如图3.3所示。然而，一些已证实与结核感染有关的固有免疫相关的信号通路并未在感染结核的树鼩模型中发现，如：Toll-like受体信号通路、NOD-like受体信号通路和Mincle/Dectin-1/DC-SIGN介导的NF-κB信号通路。

3.6部分差异蛋白转录水平的分析

　　选取部分与结核感染相关的差异蛋白通过qRT-PCR在mRNA水平对其进行验证，如图3.4所示：SHP-1、Coronin l、ASC、CD45、Cathepsin D、GSN、ITGB2、V-ATPase和STAT1表达上调，与iTRAQ结果一致；HSP90和Calnexin在mRNA水平并未上调，今后若开发有相应的抗体，可用Western blot的方法再次验证；接着对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，与iTRAQ和PCR结果大致一致。

图3.1大体病理改变

A：正常对照；B：高剂量组病重死亡；C-E：各部位多发结节；F：注射部位皮肤溃疡；G：胸水；H：头部皮下脓肿；I：肺部多发结节

图3.2组织病理改变和抗酸染色

A：脾组织肉芽肿；B：肝脏内炎细胞浸润；C：肾间质灶性炎细胞浸润；D：真皮、皮下和肌肉组织灶性坏死，炎细胞浸润；E：小脑灶性坏死；F：肾上腺灶性坏死，被膜炎细胞浸润；G：肺组织内结节性病变；H：a-i分别为肺、脾、肝、肾上腺、肾、肌肉、皮下组织、真皮和小脑抗酸染色，箭头所指为抗酸染色阳性杆菌。

图3.3部分差异蛋白参与的信号通路图

绿色方块代表高剂量组与正常对照组相比和高剂量组与低剂量组相比都差异表达的蛋白，且这些差异蛋白与结核感染相关，红色方块代表高剂量组与正常对照组相比和高剂量组与低剂量组相比都差异表达的蛋白，且这些差异蛋白与结核感染不相关；绿色字体代表高剂量组与正常对照组相比或高剂量组与低剂量组相比差异表达的蛋白，且这些差异蛋白与结核感染相关，红色字体代表高剂量组与正常对照组相比或高剂量组与低剂量组相比差异表达的蛋白，且这些差异蛋白与结核感染不相关。

图3.4部分与结核感染相关差异蛋白的mRNA水平验证

M代表低剂量组，S代表高剂量组，横坐标代表蛋白名称，纵坐标代表qRT-PCR2^-ΔΔCt值