C57BL/6J

扩增并经测序比对正确的cTnI^R145G突变片段插入α-MHC启动子下游构建心脏特异表达cTnI^R145G表达载体。用显微注射法将线性化的转基因载体注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中，用ICR小鼠作假孕受体，制备转基因小鼠。PCR法鉴定小鼠基因型，Western Blot分析cTnI^R145G突变蛋白的表达情况（图1）。

图1. cTnI^R145G转基因小鼠模型的建立及鉴定

注：将cTnI^R145G突变基因片段插入α-MHC心脏组织特异性启动子下游构建转基因表达载体（A）. PCR法鉴定小鼠基因型（B）, M: 分子量标记; 1: 阳性对照; 2: 阴性对照; 3: 空白对照;  5,8: cTnI^R145G阳性转基因小鼠; 4,6,7: 阴性转基因小鼠. Western Blot分析cTnI^R145G突变蛋白表达（C）, WT: 同龄阴性对照小鼠; F₀28, 24, 4, 45: 首建鼠28,24,4,45号; GAPDH: 内参，灰度扫描定量分析蛋白表达情况（D）.

1.从24号首建鼠仔代小鼠从出生后即陆续出现死亡，最早记录为17天，最长记录为出生后60天，至小鼠3月龄观察期终点时，经Spss16.0软件Kaplan-Meier curves分析显示，24号转基因系，与NTG小鼠、4号及45号两系小鼠及相比，生存率具有显著性差异[图2，F₀24, 0% (n = 37); F₀4, 100% (n = 16); F₀45, 96% (n = 25); P < 0.001]，而4号和45号两系小鼠与NTG小鼠生存率无显著性差异。

图2. CYP2E1转基因小鼠生存率分析

注：记录小鼠从出生至3月龄时， 24号，4号及45号转基因各系小鼠的存活率。Spss16.0软件Kaplan-Meier curves分析显示，NTG小鼠无死亡发生，24号与4及45号两系小鼠及阴性对照小鼠死亡率具有显著性差异（P < 0.001），而4号和45号两系小鼠与NTG小鼠死亡率无显著性差异。

2.于20日龄时对24号转基因系小鼠进行心脏超声影像分析，结果反映心脏形态及功能的超声参数[左室收缩末期内径(left ventricular end-systole diameter, LVESD)，左室收缩末期后壁厚度(left ventricular posterior wall at end-systole, LVPWS)及短轴缩率(percent fractional shortening, FS%)]未见明显变化。于1、3和7月龄对4号及45号转基因系阳性小鼠和NTG小鼠进行心脏超声影像分析，结果显示，与NTG小鼠相比，4号转基因系1月龄[NTG, 2.02 ± 0.21(n=26), TG, 1.78 ± 0.22 (n=8), P < 0.01]，3月龄[TG, 2.38 ± 0.26(n=25), TG,1.90 ± 0.30 (n=8), P < 0.001]及7月龄[NTG, 2.54 ± 0.22(n=18), TG, 2.06 ± 0.34(n=6), P < 0.001]小鼠LVESD显著减小（图3A），左室容积显著减小，左室后壁厚度显著增加，1月龄[NTG, 40.19 ± 4.54 (n=26), TG, 42.58 ± 5.24 (n=8)]，3月龄[NTG, 35.60 ± 4.78 (n=25), TG, 43.00 ± 6.32 (n=8), P < 0.01]及7月龄[NTG, 32.59 ± 4.69(n=18), TG, 40.63 ± 4.55(n=6), P <0.01]小鼠FS%显著增大（图3B）。同时，4号及45号转基因系小鼠超声检查结果相近，图3仅列出4号转基因系小鼠LVESD及FS%的比较结果，其他参数及45号小鼠结果未列出。

图3. cTnI^R145G转基因小鼠心脏LVESV及FS%变化

3.于7月龄时，对4号转基因系小鼠进行病理组织学观察，与NTG小鼠相比（图4A, C），转基因阳性小鼠室壁增厚，心腔缩小，心肌细胞排列出现紊乱，心肌细胞出现不均匀肥大（图4B, D）。而于20日龄时对24号转基因系小鼠进行病理组织学观察，于NTG小鼠相比（图4E），转基因阳性小鼠心肌形态结构未见明显异常（图4F）。

图4. cTnI^R145G转基因小鼠组织学改变

注：于7月龄时，阴性对照小鼠（A,C）和4号转基因系小鼠（B,D）心脏石蜡切片H&E染色长轴及高倍截图，20日龄时，阴性对照小鼠（E）及24号转基因系小鼠（F）心脏石蜡切片H&E染色高倍截图。

4.24号转基因系小鼠于出生后第20天记录II导联心电变化，LabChart软件包分析心电记录各项参数变化，结果与NTG小鼠相比，QT间期[NTG, 0.018 ± 0.0056( n=7), TG, 0.027 ± 0.0069 (n=5), P<0.05]及R-R间期[NTG, 0.123 ± 0.0094 (n=7), TG, 0.147 ± 0.0107 (n=5), P<0.01]显著延长，而QRS间期无显著变化（表1），提示24号转基因系小鼠存在心室复极化缺陷。

表1. 24号转基因系20日龄小鼠心电参数变化

注：*P <0.05；**P <0.01