| 标识符 | CSTR:16397.09.0I01001002 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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| 资源中文名称 | DNMT1心肌特异性基因敲除SD大鼠 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 资源英文名称 | DNMT1 cardiac specific knockout SD rat | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 疾病概述 | 心力衰竭，简称心衰，是指由于心脏收缩和（或）舒张功能障碍，无法将静脉回心血量充分排出心脏，导致静脉系统血液淤积，动脉系统灌注不足，从而引发心脏循环障碍症候群，心衰并不是一个独立的疾病，而是所有心血管疾病发展的终末阶段。近年来，随着我国社会老龄化和高血压，冠心病等心血管疾病发病率的增加，使得心衰呈现高发病率，高致残率和高死亡率的特点，《2018中国心力衰竭诊断和治疗指南》中报道我国心衰患病率为0.9%，有1000万左右的心衰患者。 几乎所有的心血管疾病最终都会导致心衰的发生，而在基础性心脏病的基础上，一些因素亦可诱发心衰的发生，常见诱因包括，感染，严重心律失常，心脏负荷增大，药物中毒（如洋地黄）等等。 心衰在临床上可分为急性心衰和慢性心衰。临床表现，包括呼吸困难，运动耐力下降，心室腔增大，心脏功能下降（LVEF<40-50%），心脏顺应性降低，心室腔内淤血，肺循环及体循环淤血。 临床检查手段，包括超声影像分析，心电图，心衰标志物（B型利钠肽（BNP），N末端B型利钠肽原（NT-proBNP））心肌坏死标志物（心肌肌钙蛋白T（cTnT）及心肌肌钙蛋白I（cTnI））。 临床治疗方法，包括强心（米力农，地高辛），利尿（速尿），抗感染，改善心肌重构（卡维地洛）及心脏移植。 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 实验动物背景信息 | SD大鼠 |
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| 模型制作方法 | 3.1 实验材料 3.1.1 实验动物 SD大鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司【SCXK（京）2012-001】。实验中涉及动物的操作程序已获得中国医学科学院医学实验动物研究所实验动物使用与管理委员会的批准，批准号为ZLF18003. 3.1.2实验仪器
3.1.3实验试剂
3.1.4模型构建流程 利用Cre/loxP重组系统的原理，进行条件性敲除（Conditional knockout，CKO），制备心肌组织特异性DNMT1敲除大鼠。在DNMT1基因第1外显子两端插入两个loxP位点来构建DNMT1flox/+大鼠，使其与αMHC-Cre大鼠进行杂交，经两轮杂交最终获得DNMT1flox/flox/MHC-Cre大鼠，并使用PCR方法进行基因型鉴定，使用Western blot技术进行敲除效率的鉴定。 3.1.5 DNMT1条件性敲除大鼠及心肌组织特异性Isca1敲除大鼠的建立 3.1.5.1 DNMT1条件性敲除大鼠模型的建立
（1）设计方案
图 1. DNMT1条件性敲除模型构建设计方案 （2）构建sgRNA 载体pUC57-sgRNA expression vector，根据基因信息选择靶点并合成sgRNA。
靶点1: GCCTCCTGAGCAAGTGCT GGG R- DNMT1-gRNA UP1 5’TAGGGCCTCCTGAGCAAGTGCT R- DNMT1-gRNA DOWN1 5’AAACAGCACTTGCTCAGGAGGC 靶点2: AGCCCTGAACTCCTTATG TGG R- DNMT1-gRNA UP2 5’TAGGAGCCCTGAACTCCTTATG R- DNMT1-gRNA DOWN2 5’AAACCATAAGGAGTTCAGGGCT （3）合成的sgRNA单链通过退火复性结合成小片段，插入BSA I线性化的载体，构建完成的sgRNA载体通过体外转录成为可注射的sgRNA。
（4）构建Cas9载体pST1374-NLS-flag-linker-Cas9，载体通过体外转录成为可注射的Cas9-RNA。
（5）显微注射
1）超数排卵：15只3-4周龄SD雌鼠注射激素进行超排。
2）受精卵注射：取约150枚受精卵进行注射。
3）雄鼠结扎：制作30只8周龄输精管结扎的SD雄鼠。
4）受体鼠制备：8-10周龄SD雌鼠与结扎的SD雄鼠交配后选取见栓的雌鼠。
5）胚胎移植：将注射后的受精卵移植到受体鼠输卵管壶腹部（移植一次，150枚卵，5只受体鼠）。
（6）基因型鉴定
1）剪尾编号：出生7-10天的乳鼠，剪取脚趾和尾尖进行编号及取材。
2）基因组DNA提取：使用基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA
3）PCR检测：根据序列信息设计检测引物并进行PCR检测。
（7）结果分析：选取通过PCR检测后含有不同于野生型分子量条带的鼠号，将PCR产物进行TA克隆，之后用检测引物进行菌液PCR，筛选有插入的克隆测序。
（8）根据测序结果确定Isca1条件性敲除模型大鼠（SD. DNMT1 (tm-loxp)-GC/ILAS，http://www.ratresource.com）用于后续实验。
3.1.5.2 心肌组织特异性DNMT1敲除大鼠（DNMT1flox/flox/MHC-Cre）的建立 根据3.1.5.1获得DNMT1flox/+大鼠F1代后，首先通过8周龄左右DNMT1flox/+与野生型大鼠进行杂交，获得一定数量的DNMT1flox/+大鼠。与此同时使8周龄左右Isca1flox/+大鼠与αMHC-Cre大鼠（SD. Tg(MHC-CRE)-GC/ILAS，http://www.ratresource.com）进行杂交，得到DNMT1flox/+/MHC-Cre大鼠。之后使8周龄左右DNMT1flox/+大鼠与DNMT1flox/+/MHC-Cre大鼠进行第二轮杂交，可得到DNMT1flox/flox/MHC-Cre大鼠，即心肌组织特异性Isca1敲除纯合子大鼠，用于后续实验。  图 2. DNMT1 flox/flox/MHC-Cre大鼠的繁育
3.1.5.3 鼠尾基因组DNA提取 在幼崽出生后剪脚趾标记，收集幼崽脚趾至1.5 mL EP管。然后参照DNA提取试剂盒说明书按以下程序操作。 （1）加入100 μL LB2和20 μL Proteinase K，55℃摇床孵育至完全裂解。
（2）12000 rpm 离心5 min，转移上清于一无菌的离心管中。
（3）加入500 μLBB2，立即涡旋5 s，室温孵育10 min。
（4）将全部的溶液加入离心柱中，8000 rpm离心1 min，弃掉流出液。
（5）加入500 μL CB2溶液，12000 rpm离心1 min，弃掉流出液。
（6）重复步骤（5）一次。
（7）加入500 μL WB2（使用前加入88 mL无水乙醇），12000 rpm 离心1 min，弃掉流出液。
（8）重复步骤（7）一次。
（9）10000 rpm 离心2 min，彻底去除残留的WB2。
（10）将离心柱置于一干净的离心管中，开盖静置5 min，在柱的中央加入50~200 μL预热EB（60℃~70℃），盖上盖子，室温静置3 min，12000 rpm 离心2 min，洗脱DNA。保存至4℃冰箱。 |
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| 模型表型数据 | 4.1 心肌组织特异性DNMT1敲除大鼠模型的建立 利用Cre/loxP重组系统的原理，进行条件性敲除（Conditional knockout，CKO），制备心肌组织特异性DNMT1敲除大鼠。在DNMT1基因第三外显子两端插入两个loxP位点来构建DNMT1flox/+大鼠，使其与αMHC-Cre大鼠进行杂交，经两轮杂交最终获得DNMT1flox/flox/MHC-Cre大鼠，通过PCR方法进行基因型鉴定心肌组织特异性DNMT1敲除大鼠基因型（图3）。免疫印迹Western blot方法鉴定DNMT1flox/flox/MHC-Cre大鼠DNMT1蛋白的敲除效率达65.8%（图4）。
图3 PCR鉴定琼脂糖凝胶电泳图
图4 Western blot 检测Dnmt1蛋白在心肌组织中的敲除效率
4.2 ADR药物处理后心肌组织特异性Dnmt1敲除大鼠生存率观察 在正常生理状态下，Dnmt1于心肌组织内敲除，未见明显异常。于是我们随即用阿霉素对大鼠进行处理，观察在面对病理刺激时，Dnmt1的缺失对心肌病理进程是否有影响。结果，WT-saline组，KO-saline组及KO-ADR组，直至观察末期未见动物死亡，生存率为100%。而WT-ADR组生存率为75%,（图5，WT-saline（n = 8）组与WT-ADR（n = 8）相比，P = 0.143）。与WT-ADR组相比，KO-ADR组增加了25%的生存率。Dnmt1敲除可增加经ADR药物处理后的生存率。但无统计学意义。
图5 ADR药物处理后心肌组织特异性Dnmt1敲除大鼠生存率分析
4.3 ADR药物处理后心肌组织特异性Dnmt1敲除大鼠心脏结构和功能分析 四组大鼠连续给予ADR药物处理2周，给药终点后观察2周，观察终点时各组大鼠进行超声影像学观察。结果显示，WT-ADR组大鼠LVIDS（左心室收缩末期内径，Left ventricular end-systolic diameter）增加了23.9%（图6，n=6，P<0.05）；LVAWS（收缩期左心室前壁厚度，Left ventricular anterior wall; systolic）下降了16.8%（图6，n=6，P<0.05）；FS%（短轴缩短率，Fractional shortening）下降了19.3%（图6，n=6，P<0.05）。 与WT-ADR大鼠相比，KO-ADR大鼠超声参数指标改善显著。与KO-saline组大鼠相比，KO-ADR组大鼠LVIDS增加了13.9%（图6，n=6，P=0.224）；LVAWS下降了14.6%（图6，n=6，P=0.053）；FS%下降了11.8%（图6，n=6，P=0.223），但上述3个超声参数均无显著性差异（n=6，P>0.05）。 
图6 ADR药物处理后大鼠超声参数分析
4.4 ADR药物处理后心肌组织特异性Dnmt1敲除大鼠心肌病理组织学观察 Dnmt1敲除可以显著改善ADR药物处理后心脏在体形态和功能，随后我们进一步分析药物处理后，各组大鼠心肌显微和超微水平病理组织学变化情况。 摘取大鼠心脏，称取心脏湿重，计算HW/BW比值；制备心脏病理组织切片，H&E及Masson染色观察大鼠心肌显微水平病理组织变化；切取大鼠心肌组织，制备电镜样本，TEM观察心肌超微水平组织学变化。 HW/BW比值结果显示，WT-ADR组大鼠，HW/BW增加了14.9%（图7，n=6，P<0.05）。与KO-saline组大鼠相比，KO-ADR组大鼠HW/BW增加了4.5%（图7，n=6，P=0.384），无统计学差异。
图7 ADR药物处理后各组大鼠HW/BW比值分析
H&E及Masson染色结果显示，WT-ADR组大鼠心脏整体增大，心室腔扩张，室壁变薄，心肌纤维排列不齐，心肌纤维出现断裂，心肌纤维化程度显著增加等现象。与KO-saline组大鼠相比，KO-ADR大鼠心脏整体扩张情况明显改善，心肌纤维断裂及纤维化程度改善明显。TEM结果显示，WT-saline组大鼠心肌纤维清晰可见，排列有序，心肌线粒体形态多呈椭圆形，排列整齐有序，双层膜结构清楚，嵴结构致密。WT-ADR组大鼠，心肌纤维出现明显断裂溶解，肌节出现模糊不清，线粒体发生嵴断裂，甚至空化，肿胀明显（图8）。与KO-saline组大鼠相比，KO-ADR大鼠心肌纤维断裂溶解现象改善明显，线粒体肿胀空化现象亦明显改善。
图8 ADR药物处理后各组大鼠心肌病理组织学观察 |
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| 动物模型的评价与验证 | 评价该动物模型中采用的生理、生化和病理方法，包括行为、影像、生理生化和组织切片等技术方法及评价模型成功的指标进行详细介绍。采用的仪器设备应满足模型评价的要求，指标完善，条件稳定。 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 保存方式 | 冷冻保存 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 合作方式 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 相关文章 | Wu TT, Ma YW, Zhang X, Dong W, Gao S, Wang JZ, Zhang LF, Lu D. Myocardial tissue-specific Dnmt1 knockout in rats protects against pathological injury induced by Adriamycin. Lab Invest. 2020 Jul;100(7):974-985. (IF=4,197) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 备注 |
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