| 标识符 | CSTR:16397.09.0L01001001 |
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| 资源中文名称 | CD4+T细胞GPR68基因敲除黑色素瘤小鼠皮下移植瘤模型 |
| 资源英文名称 | Model of transplanted B16 melanoma in CD4+ T cell GPR68 Ko mice |
| 疾病概述 | 黑色素瘤指有恶性变化的色素斑痣，是由交界痣或混合痣性质的痣发展而来。虽然不一定由斑痣恶变，但是慢性刺激和不恰当的治疗对斑痣转变成黑色素瘤有很大的关系。黑色素瘤表现为黑痣突然出现或迅速长大，色泽不断加深，四周出现彗星状小瘤或色素环，局部发生疼痛、感染、溃疡或出血，出现肿大的淋巴结。肿瘤为单一实性，常有包膜，颜色可黑色、红棕色，深浅程度不一，也可无色素性。大多数黑色素瘤是原发性的，累及成人和儿童，特别是有神经皮肤症状的儿童。肿瘤好发于下肢，其次是头、颈、上肢、眼、指甲下和阴唇等处。早期即能由淋巴道和血行转移至肝、脑、骨、黏膜等处。经常受摩擦的手掌、足底和眼部的黑痣以及位于表皮和真皮交界处的黑痣容易恶变，被认为是黑色素瘤的前驱期。 |
| 实验动物背景信息 | C57BL/6J小鼠 |
| 模型制作方法 | （一）构建GPR68-FloxP小鼠 1、实验设计 GPR68只有一个蛋白编码区exon1。因此在exon1的两边设计gRNA靶点，将FloxP基因插入GPR68基因两端。
图2 插入位点设计 2、Cas9/gRNA的活性检测 采用北京唯尚立德Cas9/gRNA靶点效率检测试剂盒检测gRNA靶点体外酶切活性。选体外活性高的gRNA显微注射受精卵，取胚胎检测内源活性。根据Cas9/gRNA的内源活性结果，选用活性较高的gRNA进行后续实验。 3、构建同源重组模板（Donor质粒） 根据靶点的位置设计并构建Donor DNA。 4、基因敲除小鼠的建立和和品系交配GPR68-FloxP小鼠的构建 将Cas9nickase、 GPR68-L1和GPR68-R1体外转录成mRNA和RNA后，加上Donor DNA显微注射到小鼠的受精卵中，以高效获得基因敲入的小鼠。采用直接注射受精卵实现基因敲除，由于在受精卵发育早期，甚至单细胞时期就发生基因敲入，因此小鼠嵌合率高，小鼠传种的几率比囊胚注射ES Cell高。 小鼠出生2周后，剪鼠尾，提取基因组DNA进行PCR加上测序检测小鼠基因型，测序检测是否实现了两个位点的FloxP精确插入。 5、CD4+T细胞特异性敲除GPR68小鼠的构建
图3 GPR68-FloxP小鼠与CD4-Cre小鼠杂交 将GPR68-Flox/Flox小鼠与CD4-Cre小鼠杂交，子代小鼠即为CD4+T细胞GPR68特异敲除小鼠。 （二）皮下移植黑色素瘤模型的构建 1、用0.25%胰酶消化细胞收集细胞悬液，用预冷的PBS重悬细胞，1000rpm离心5min，洗涤细胞两次，除去单细胞悬液中的血清。 2、对细胞进行计数，用PBS稀释细胞至浓度为2.5×106个/mL，接种体积控制在0.2mL。 3、采用1mL无菌注射器于小鼠腋下部位接种细胞。接种时将单细胞悬液充分混匀，防止细胞成团导致活性降低以及接种细胞数不均，左手固定小鼠，右手执注射器，针头在皮下穿行时避免刺破皮肤与肌肉，到达接种位点并注射完毕后退出针头时避免细胞悬液溢出。 4、每3天用游标卡尺测量肿瘤大小，测量肿瘤最长和最短直径。肿瘤体积计算公式为V=a×b2/2(a为长轴，b为短轴)。 5、接种后第20天实验结束，采用颈椎脱臼法处死小鼠，解剖取出肿瘤组织，称量小鼠肿瘤重量。 |
| 模型表型数据 | 在无特殊刺激的情况下，CD4+T细胞GPR68特异敲除小鼠没有明显表型，且外观与同背景WT小鼠无明显差异。分别从DNA、mRNA、蛋白水平检测CD4+T细胞GPR68特异敲除小鼠组织中GPR68表达，如图4所示，在此三个水平上均不能检测到GPR68。
图4 鉴定GPR68-/-小鼠组织中GPR68的表达 a.鼠尾DNA水平的鉴定；b. mRNA水平鉴定；c.蛋白水平鉴定 分别对WT与CD4+T细胞GPR68特异敲除小鼠进行皮下注射接种5×105个B16细胞，观察并检测肿瘤生长情况。接种后第20天，采用颈椎脱臼法处死小鼠，称量小鼠肿瘤重量体积等。如图5所示，与WT小鼠比较，CD4+T细胞GPR68特异敲除小鼠能够明显抑制黑色素瘤的生长。
图5 CD4+ T 细胞GPR68敲除对黑色素瘤生长的抑制作用 a.肿瘤大小；b.肿瘤重量；c.肿瘤体积 |
| 动物模型的评价与验证 | 1.DNA鉴定 提取小鼠脾脏中的CD4+T细胞，采用全式金DNA提取试剂盒提取总DNA，进行PCR扩增后，通过琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。 2.mRNA鉴定 提取小鼠脾脏中的CD4+T细胞，采用赛默飞反转录试剂盒进行反转录得到cDNA，通过Real time PCR鉴定小鼠CD4+T细胞中mRNA水平GPR68的表达情况。 3.蛋白表达鉴定 提取小鼠脾脏中的CD4+T细胞，采用赛默飞蛋白定量试剂盒进行定量后通过Western blot鉴定小鼠CD4+T细胞中蛋白水平GPR68的表达情况。 |
| 保存方式 | 冷冻保存,活体繁殖 |
| 合作方式 | |
| 相关文章 |
[1]李维莎,刘宏飞,严立波,等. OGR1与肿瘤微环境 [J]. 中国比较医学杂志, 2019, 29(7):96-101. [2]Wenlong Zhang,Yong Han,Weisha Li，et al. Clinical data analysis reveals the role of OGR1 (GPR68) in head and neck squamous cancer[J]. Animal Models and Experimental Medicine，2020 Mar 18;3(1):55-61. |
| 备注 |
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