c57bl/6小鼠也被称为c57 black 6，1921年被培育出来，属于近交品系。该品系的最主要的两个特点就是品系稳定和易于繁殖。另外c57bl/6小鼠是第一个完成基因组测序的小鼠品系。

3.1 实验材料

3.1.1 实验动物

本实验使用SPF级C57BL及ICR小鼠，购买于北京维通利华实验动物有限公司【SCXK（京）2012-001】并在本所SPF级动物屏障环境动物房[SYXK(京)2015-0035]中长期饲养繁殖。涉及动物操作程序和动物实验经本所动物使用与管理委员会（IACUC）批准，批准号为BL18003。

3.1.2实验仪器

3.1.3实验试剂

3.1.4模型构建流程

利用CRISPR /Cas9 技术，建立CTLA4基因敲除小鼠模型，利用PCR、RT-PCR和Western Blot 的方法进行鉴定及分析。

3.1.5 CTLA4敲除小鼠的建立

3.1.5.1 CTLA4敲除小鼠模型的建立

（1）设计方案

• 载体构建

1，sgRNA 载体

• 载体名称：pUC57-sgRNA expression vector
• Addgene ID: 51132
• 根据基因信息选择靶点，合成sgRNA（上海英潍捷基）

gggttcaaacacatctca    agg

• m-ctla4-gRNA up1      5’TAGGgggttcaaacacatctca
• m-ctla4-gRNA down1    5’aaacTGAGATGTGTTTGAACCC
• targeting site 2:
• gagacttctggaacatgg    aGg
• m-ctla4-gRNA up2      5’TAGGgagacttctggaacatgg
• m-ctla4-gRNA down2    5’aaacCCATGTTCCAGAAGTCTC
• 合成的sgRNA单链通过退火复性结合成小片段，插入BSAⅠ线性化的载体
• sgRNA插入位点示意图
• 

图1 CTLA4敲除小鼠模型构建设计方案

• 构建完成的sgRNA载体通过体外转录成为可注射的sgRNA。（体外转录用试剂盒：Ambion  Am1354）
• 2，CAS9 载体
• 载体名称：pST1374-NLS-flag-linker-Cas9
• Addgene ID: 44758
• 载体通过体外转录成为可注射的Cas9-RNA（体外转录用试剂盒：Ambion  Am1345）
• 显微注射
• 1，超数排卵：15只3-4周龄c57雌鼠注射激素进行超排。
• 2，受精卵注射：取约150枚受精卵进行注射。
• 3，雄鼠结扎：制作30只8周龄输精管结扎的c57雄鼠。
• 4，受体鼠制备：8-10周龄ICR雌鼠与结扎的ICR雄鼠交配后选取见栓的雌鼠。
• 5，胚胎移植：将注射后的受精卵移植到受体鼠输卵管壶腹部（移植一次， 120枚卵，4只受体鼠）。
• 基因型鉴定
• 1，剪尾编号：出生7-10天的乳鼠，剪取脚趾和尾尖进行编号及取材。
• 2，基因组DNA提取： 使用全式金（Transgen）公司的基因组DNA提取试剂盒（EE101-12）提取基因组DNA
• 3，PCR检测：根据序列信息设计检测引物（上海英潍捷基）
• M-CTLA4-KO-S    5’AGAAATTATACTCTCCAAGACTCCACG    
• M-CTLA4-KO-A    5’CCTTAAGTCCCAGCTGAGATCC     
• KO：
• TM=62℃       WT：727bp    ko: (见测序分析)
• PCR反应体系及扩增程序（TaKaRa RR042A）
• 反应体系：

• 扩增程序：

• 6×loading buffer 终止反应。
• 用1%的琼脂糖凝胶进行电泳。
• 4，结果分析： 选取PCR检测分子量不同于野生型条带的 (下图中箭头所示)，将PCR产物进行TA克隆，之后用检测引物进行菌液PCR，筛选有插入的克隆测序。
•    1-23#基因组PCR结果图（TaKaRa marker DL2000）（上游PCR结果）
• 1-23#基因组PCR结果图（TaKaRa marker DL2000）（KO  PCR结果）
•  
• 5，测序结果：
• KO：4#，6#，7#，10#，15#    灰色为缺失部分
• 4#
• agaaattatactctccaagactccacgtctccaggtcctcagaggtgactcgaagcttcagtttcaagttgagtacattttccatccatggatttgcttgttttgttcagttttagtttgaatatttgaggtcgtctttacgacgtaacagctaaacccacggcttcctttctcgtaaaaccaaaacaaaaaggctctctgttcaggtgtcctgtgtgtgcactacacatatgtagcacgtaccttggatcaaagctgtctatataaagtccccgagtctgtgtgggttcaaacacatctcaaggcttctggatcctgttgggttttactctgctccctgaggacctcagcacatttgccccccagccatggcttgtcttggactccggaggtacaaagctcaactgcagctgccttctaggacttggccttttgtagccctgctcactcttcttttcatcccagtcttctctgaaggtgagtggagacttctggaacatggaggtggaggaggtgtttttcctacatgggtttcgttttttttttttctttcagaagctgaggacagtgatttatagaaatgccagaagttaaagccaaaccctctactttttggtttaacagcttcctacagacaagttccaagaagaatataggaggtctagcagtagcgaaggagctgagactagccacagcagcttgctgggatctcagctgggacttaagg
• 6#
• agaaattatactctccaagactccacgtctccaggtcctcagaggtgactcgaagcttcagtttcaagttgagtacattttccatccatggatttgcttgttttgttcagttttagtttgaatatttgaggtcgtctttacgacgtaacagctaaacccacggcttcctttctcgtaaaaccaaaacaaaaaggctctctgttcaggtgtcctgtgtgtgcactacacatatgtagcacgtaccttggatcaaagctgtctatataaagtccccgagtctgtgtgggttcaaacacatctcaaggcttctggatcctgttgggttttactctgctccctgaggacctcagcacatttgccccccagccatggcttgtcttggactccggaggtacaaagctcaactgcagctgccttctaggacttggccttttgtagccctgctcactcttcttttcatcccagtcttctctgaaggtgagtggagacttctggaacatggaggtggaggaggtgtttttcctacatgggtttcgttttttttttttctttcagaagctgaggacagtgatttatagaaatgccagaagttaaagccaaaccctctactttttggtttaacagcttcctacagacaagttccaagaagaatataggaggtctagcagtagcgaaggagctgagactagccacagcagcttgctgggatctcagctgggacttaagg
• 7#
• agaaattatactctccaagactccacgtctccaggtcctcagaggtgactcgaagcttcagtttcaagttgagtacattttccatccatggatttgcttgttttgttcagttttagtttgaatatttgaggtcgtctttacgacgtaacagctaaacccacggcttcctttctcgtaaaaccaaaacaaaaaggctctctgttcaggtgtcctgtgtgtgcactacacatatgtagcacgtaccttggatcaaagctgtctatataaagtccccgagtctgtgtgggttcaaacacatctcaaggcttctggatcctgttgggttttactctgctccctgaggacctcagcacatttgccccccagccatggcttgtcttggactccggaggtacaaagctcaactgcagctgccttctaggacttggccttttgtagccctgctcactcttcttttcatcccagtcttctctgaaggtgagtggagacttctggaacatggaggtggaggaggtgtttttcctacatgggtttcgttttttttttttctttcagaagctgaggacagtgatttatagaaatgccagaagttaaagccaaaccctctactttttggtttaacagcttcctacagacaagttccaagaagaatataggaggtctagcagtagcgaaggagctgagactagccacagcagcttgctgggatctcagctgggacttaagg
• 10#
• agaaattatactctccaagactccacgtctccaggtcctcagaggtgactcgaagcttcagtttcaagttgagtacattttccatccatggatttgcttgttttgttcagttttagtttgaatatttgaggtcgtctttacgacgtaacagctaaacccacggcttcctttctcgtaaaaccaaaacaaaaaggctctctgttcaggtgtcctgtgtgtgcactacacatatgtagcacgtaccttggatcaaagctgtctatataaagtccccgagtctgtgtgggttcaaacacatctcaaggcttctggatcctgttgggttttactctgctccctgaggacctcagcacatttgccccccagccatggcttgtcttggactccggaggtacaaagctcaactgcagctgccttctaggacttggccttttgtagccctgctcactcttcttttcatcccagtcttctctgaaggtgagtggagacttctggaacatggaggtggaggaggtgtttttcctacatgggtttcgttttttttttttctttcagaagctgaggacagtgatttatagaaatgccagaagttaaagccaaaccctctactttttggtttaacagcttcctacagacaagttccaagaagaatataggaggtctagcagtagcgaaggagctgagactagccacagcagcttgctgggatctcagctgggacttaagg
• 15#
• agaaattatactctccaagactccacgtctccaggtcctcagaggtgactcgaagcttcagtttcaagttgagtacattttccatccatggatttgcttgttttgttcagttttagtttgaatatttgaggtcgtctttacgacgtaacagctaaacccacggcttcctttctcgtaaaaccaaaacaaaaaggctctctgttcaggtgtcctgtgtgtgcactacacatatgtagcacgtaccttggatcaaagctgtctatataaagtccccgagtctgtgtgggttcaaacacatctcaaggcttctggatcctgttgggttttactctgctccctgaggacctcagcacatttgccccccagccatggcttgtcttggactccggaggtacaaagctcaactgcagctgccttctaggacttggccttttgtagccctgctcactcttcttttcatcccagtcttctctgaaggtgagtggagacttctggaacatggaggtggaggaggtgtttttcctacatgggtttcgttttttttttttctttcagaagctgaggacagtgatttatagaaatgccagaagttaaagccaaaccctctactttttggtttaacagcttcctacagacaagttccaagaagaatataggaggtctagcagtagcgaaggagctgagactagccacagcagcttgctgggatctcagctgggacttaagg

3.1.5.2 动物繁殖和表达图谱分析

获得F0代后，首先通过与野生型C57小鼠进行杂交，进行基因修饰小鼠传代能力分析。之后CTLA4敲除小鼠通过杂合子与杂合子杂交，获得CTLA4敲除小鼠纯合子小鼠，进行蛋白表达分析，并用于后续实验。

3.1.5.3 鼠尾基因组DNA鉴定

在幼崽出生后剪脚趾标记，并剪尾至1.5 mL EP管。然后参照鼠尾直接PCR试剂盒（bimake）说明书按以下程序操作。

1.1. 按小鼠数量配制组织消化液，试剂比例如下：

组织消化液现用现配，充分混匀后使用。

1.2. 向每个含有样本的EP管中加入100 μL新鲜组织消化液，55℃水浴/金属浴中消化15 min。组织消化时，务必将组织完全浸没于消化液中。消化完成后，组织外观上仍然完整，但足量的基因组DNA已经释放，不影响后续的PCR实验。

1.3. 将样本置于95℃水浴/金属浴中孵育5 min以灭活消化液中的蛋白酶活性。12000 rpm离心5分钟，取上清作为PCR模板。消化后的上清或连同组织的消化液可于-20℃保存三个月。

2. PCR扩增

2.1. PCR反应体系：

2.2. PCR反应条件：

3. 琼脂糖凝胶电泳

试剂2 x M-PCR OPTITM Mix中含有溴酚蓝染料，PCR产物可直接点样进行琼脂糖凝胶电泳。

4.1CTLA4敲除小鼠模型的建立

将F0代小鼠与C57小鼠进行杂交，获得杂合子CTLA4 +/-,将杂合子互交并将子代进行基因型鉴定（图2），得到纯合敲除小鼠CTLA4 -/-。

注：使用PCR鉴定子代小鼠基因型，突变可传代。M：Marker（TaKaRa，DL2000）；H: 水。-/-：CTLA4基因敲除纯合子小鼠；+/-：CTLA4基因敲除杂合子小鼠；+/+：野生型小鼠。

图2 PCR鉴定子代小鼠基因型

4.2 CTLA4敲除小鼠生存率及体重变化

早有研究表明，CTLA4基因敲除小鼠会在出生后1月内，由于严重的自身免疫疾病死亡。我们统计了小鼠出生后的生存率及体重变化， CTLA4基因敲除小鼠在出生后3-5周内死亡（图3a）。CTLA4基因敲除小鼠在出生后2周时体重与野生型小鼠相差不多，但在3-4周时体重明显轻于野生型小鼠（图3b），体型也更小（图3c）。

注：a：CTLA4基因敲除及同窝野生型小鼠出生后8周内的生存率，CTLA4基因敲除小鼠在出生后3-5周内死亡（n=8）。b: CTLA4基因敲除及同窝野生型小鼠出生4周内的体重变化，CTLA4基因敲除小鼠在出生2周后体重增长缓慢（n=6）。c：CTLA4基因敲除及同窝野生型小鼠体型对比。

图3 CTLA4基因敲除小鼠生存率及体重变化

4.3 CTLA4敲除小鼠组织中蛋白表达

为了鉴定转基因小鼠是否在蛋白水平发生CTLA4敲除，取1-2月龄小鼠脾、肺进行Western Blot，分别使用种属反应性为小鼠、大鼠和人的CTLA4抗体检测蛋白表达（图4）。

注： +/+：野生型小鼠；-/-：CTLA4基因敲除纯合子小鼠。

图4CTLA4在敲除小鼠中的蛋白及mRNA表达

4.4 敲除CTLA4基因可导致自身免疫疾病

文献报道，CTLA4基因敲除小鼠会由于严重的自身免疫疾病，在出生后3-4周内死亡，这与我们观察到的结果相似。HE染色结果显示，CTLA4敲除小鼠表现出淋巴样细胞向非淋巴组织（如心脏、肝脏）的浸润（图5b，d）。

注：在CTLA4^-/-小鼠中，淋巴细胞广泛浸润到非淋巴组织中（b, d），图中显示的是心脏（a，b）和肝（c，d）的组织切片HE染色。比例尺=100μm。

图5组织中淋巴细胞浸润