Foxi3敲除小鼠---先天性小儿畸形动物模型-

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资源中文名称

Foxi3敲除小鼠---先天性小儿畸形动物模型

资源英文名称

疾病概述

小耳畸形的病因目前还不完全明确，环境和遗传因素是目前小耳畸形病因研究的重点。先天性小耳畸形在基因突变致病性研究方面还没有阐明小耳畸形胚胎发育的机制。小耳畸形主要涉及胚胎发育期间第一和第二鳃弓的异常，主要表型涉及外耳发育异常。外耳的耳廓是由第一和第二鳃弓的逐渐融合形成的，在发育过程中第一和第二鳃弓之间是相互作用，两弓之间的凹槽加深，形成外耳道，从胚胎的起源来分析，外耳的发育至少在一定程度上是由第一和第二鳃弓通过后脑的部分区域来介导的，后脑是鳃弓的神经嵴细胞的来源，在后脑的第四段基因突变可以导致外耳的发育缺陷。

实验动物背景信息

利用Cre/loxP重组系统的原理，进行基因敲除（knockout，KO），制备FOXI3敲除小鼠。小鼠的背景品系是C57BL/6。

模型制作方法

(一)设计方案：

Foxi3 forkhead box I3 [ Mus musculus (house mouse) ]

Gene ID: 232077

Location: 6; 6 C1

Exon count: 2

（二）根据基因信息选择靶点，合成sgRNA

targeting site 1:

tcccaggtataagagacg cgg

M-FOXI3-sgRNA-UP1 5’TAGGtcccaggtataagagacg

M-FOXI3-sgRNA-DOWN1 5’aaacCGTCTCTTATACCTGGGA

targeting site 2:

atcgctcctcagacttga tgg

M-FOXI3-sgRNA-UP2 5’TAGGatcgctcctcagacttga

M-FOXI3-sgRNA-DOWN2 5’aaacTCAAGTCTGAGGAGCGAT

(三)显微注射

1，超数排卵：15只3-4周龄C57雌鼠注射激素进行超排。

2，受精卵注射：取约150枚受精卵进行注射。

3，雄鼠结扎：制作30只8周龄输精管结扎的ICR雄鼠。

4，受体鼠制备：8-10周龄ICR与结扎的ICR雄鼠交配后选取见栓的雌鼠。

5，胚胎移植：将注射后的受精卵移植到受体鼠输卵管壶腹部（移植一次， 150枚卵，5只受体鼠）。

(四)显微注射基因型鉴定

1，剪尾编号：出生7-10天的乳鼠，剪取脚趾和尾尖进行编号及取材。

2，基因组DNA提取：使用全式金（Transgen）公司的基因组DNA提取试剂盒（EE101-12）提取基因组DNA

3，PCR检测：根据序列信息设计检测引物（上海英潍捷基）

M-FOXI3-ko-s 5’CAAATAAGTAGTCAATCCACTCAAACG 61.4℃

M-FOXI3-ko-a 5’TCCCACCCTTAACTCCAATGAC 62.3℃

M-FOXI3-wT-s 5’GGGCTGATTGATCTCTGAGTTC 60.2℃

M-FOXI3-wT-A 5’AGGTGCTGAGGAAAGTGTTGAG 60.8℃

M-FOXI3-ko-s&A: TM=61℃ KO 603bp

M-FOXI3-wt-s&A: TM=60℃ WT 496bp

PCR反应体系及扩增程序（TaKaRa RR042A）

4，反应体系：

10×LA PCR BufferⅡ(Mg2+ Plus)	2.0 μl
dNTP Mixture(2.5 μM)	1.6 μl
引物-S（50 μM ）	0.2 μl
引物-A（50 μM ）	0.2 μl
模板DNA	2.0 μl
LA Taq	0.2 μl
补加ddH2O至总体积	20.0 μl

5，扩增程序：

95℃

15 min；

95℃, 30 s

TM-2℃, 30 s

72℃, 1 min 30循环；

72℃

min；

6×loading buffer 终止反应。

用1%的琼脂糖凝胶进行电泳。

模型表型数据

foxi3敲除小鼠纯合子胚胎有耳部畸形表型，外耳明显小于正常，失去正常小鼠耳廓亚结构形态, 外耳道未见，其耳廓形态与人先天性小耳畸形比较类似。

动物模型的评价与验证

保存方式

合作方式

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