以二花脸公猪和沙子岭母猪为祖代个体，构建近交群体。HOXA1基因突变筛查：

由于HOXA1基因编码区的c.451G>TC突变导致

二花脸×沙子岭F₂近交群体：此群体由1头二花脸公猪和1头沙子岭母猪杂交，选取全同胞的1头F₁公猪和1头F₁母猪，互交六胎次，生产F₂个体。

二花脸×沙子岭F₂近交群体，患病个体为双侧外耳缺失伴发外耳道闭锁，颞部CT显示为双侧外耳道闭锁、中耳结构发育不良；进一步的基因检测为HOXA1纯合突变。HOXA1基因纯合突变的猪动物模型，复合人类双侧小耳畸形畸形特征，为其进一步在小耳畸形病理机制中的应用提供基础。

1. 动物模型查体

与正常个体相比，患病个体表现为：外耳明显变小甚至完全缺失，见于双侧耳；外耳道完全闭锁、少数仅仅存留一个瘘管样结构；身材矮小；呼吸急促；几乎不主动吃奶，人工喂养时也不能正常进食；呆滞；平衡感差；出生后两周内死亡。

图 1  全同胞患病和正常仔猪的外耳表型图

为了进一步了解患病仔猪的各器官组织的发育情况，我们选择了3头患病个体进行解剖观察。结果显示患病个体的各器官组织无明显发育异常。沿着外耳道闭锁的小孔剪开患病个体的面部表皮和肌肉组织后，可见外耳道缺失；呈现为瘘管样小孔向里延伸形成发育不良的狭窄外耳道，底部闭锁未见鼓膜。

图 2  患病仔猪耳部解剖图

注：患病个体的外耳闭锁为一个小孔，如1所示。剪开皮肤组织，可见有些患病个体具有狭窄的外耳道，如2和3所示；有些患病个体的外耳道呈游离状态，如4所示。5为正常的外耳道。

2. CT检测

为了明确患病个体的中耳及内耳情况，我们选择了1头正常个体和它的1头全同胞双侧耳朵缺失的患病个体，进行128层螺旋CT（Definition AS128，西门子，德国）头部扫描。扫描结果显示：患病个体双侧外耳道闭锁消失。中耳发育畸形。内耳未见明显异常。

图 3 全同胞正常和患病个体的头部螺旋CT

注： 左侧为正常个体，具有正常的外耳道(EAM)和乳突(MP), 图中的标尺线为5mm；右侧为患病个体，无外耳道（EAM）和乳突(MP)，图中的标尺线为5mm。

3. HOXA1基因突变检测

突变位于HOXA1基因CDS区的第451个碱基处，由G突变为TC，即c.451G>TC，患病个体和两头F0个体的sanger测序峰图如图所示。ORF分析表明此缺失插入突变造成了HOXA1蛋白翻译移框，导致第151位的丙氨酸A突变为亮氨酸L，从第151位氨基酸开始往后的所有氨基酸序列都发生改变，还形成了一个新的终止密码子TAA，使HOXA1蛋白的翻译提前终止，编码的氨基酸由336个减少为177个。功能分析表明突变蛋白缺少了HOX基因家族唯一的功能结构域homeobox。

图4  c.451G>TC的测序峰图及突变蛋白示意图