TBX6相关先天性脊柱侧凸小鼠模型-

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TBX6相关先天性脊柱侧凸小鼠模型

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疾病概述

先天性脊柱侧凸即通过X线，MRI或手术证实的特定的先天性椎体异常而引起的脊柱侧凸。这种畸形出生后即发病，因而患者出现畸形较特发性脊柱侧凸早。早期发病使先天性脊柱侧凸患者很少能接受到早期最佳的治疗。

实验动物背景信息

FVB/NJ品系基因敲除小鼠。

模型制作方法

我们采用CRISPR-Cas9技术编辑小鼠基因组。表 1中显示了小鼠基因组中指导RNA的靶标。我们混合了向导RNA和Cas9 mRNA（每个RNA 10 ng /μl），注射到FVB / NJ品系小鼠的合子（每次注射编辑200个细胞）。取得F0小鼠后，与野生型FVB / NJ小鼠杂交以获得后代。我们使用来自脚趾的基因组DNA，通过PCR和Sanger测序对小鼠进行基因分型。用于扩增和测序的PCR引物在表 2中显示。

表 1. 小鼠基因组中单向导RNA（sgRNA）的靶序列。

Location of target region	Sequences (5’-3’)
Exon 2 of Tbx6	GAGGCCCTTCACTCGCTTCC
Conserved regulatory region in the Tbx6 promoter	CCTAGGGATCAATCAGACCGAGG

Note: Sequences of sgRNA targets are underlined and the protospacer adjacent motif (PAM)sequences are shown in red.

表 2. 小鼠Tbx6基因分型的引物。

Primer	Sequence
Tbx6mh-F	5'-CAAGCGTCAGAGAAGACCACCA-3'
Tbx6mh-R	5'-CCTTACCCAGAGCCAATCCAAC-3'
Tbx6-exon 2-F	5'-ATCCTCATTCTTCCCACATCTC-3'
Tbx6-exon 2-R	5'-ATGCCCACCTCTTACAGTTTCT-3

模型表型数据

1. 剂量依赖性的先天性椎体畸形复合遗传模型

使用小鼠胚胎的体内测定，我们展示了剂量依赖性的先天性椎体畸形复合遗传模型。该模型由Tbx6无效等位基因 (‒) 和亚等位基因（mh）组成。(A) 阿尔新蓝染色的E14.5小鼠胚胎的背面视图。显示了一个没有明显椎体畸形的胚胎。(B) 显示了一个具有椎体畸形的胚胎。红点和箭头分别表示椎体畸形和肋骨融合。比例尺为1mm。 (C) 在Tbx6 + / +，Tbx6 + / mh，Tbx6 mh / mh或Tbx6 + / ‒ 的E14.5小鼠胚胎中未观察到明显的椎体畸形，而Tbx6 mh / ‒ 胚胎表现出高穿透率的椎体畸形。样本量显示在下面的列中。****，P ＜0.0001。

2. 成年小鼠的Micro-CT结果

成年小鼠的Micro-CT结果。(A) 通过Micro-CT扫描显示成年小鼠的背侧和腹侧图像，未见明显椎体畸形。(B) 通过Micro-CT扫描显示一只具有椎体畸形的小鼠。白色箭头和箭头分别指示椎体畸形和肋骨融合。(C) Tbx6 + / +，Tbx6 + / mh，Tbx6 mh / mh，Tbx6 + / + 和Tbx6 mh / ‒ 基因型的成年小鼠Micro-CT图像。样本量显示在每列下方。 ****，P ＜0.0001。

动物模型的评价与验证

保存方式

合作方式

Yang N, Wu N, Zhang L, et al. TBX6 compound inheritance leads to congenital vertebral malformations in humans and mice. Hum Mol Genet. 2019;28(4):539–547.

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