2009年甲型H1N1流感雪貂模型-

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2009年甲型H1N1流感雪貂模型

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疾病概述

流感是由流感病毒引起的一种急性呼吸道传染病，它通过飞沫传播，能在短时间内迅速蔓延。2009年起源于北美的甲型H1N1流感曾经造成世界范围内的大流行，WHO曾将其警戒级别提升至最高级别6级，给人类社会和经济造成极大的负面影响。一项由WHO组织开展的研究显示，在2009至2010年的流感季中，全世界共有20%至27%的人被甲型H1N1病毒感染。尽管2010年8月WHO宣布全球已进入“流感大流行后期”，意味着“正常监测显示大多数国家的流感活动水平已恢复到季节性流感水平”，但同时指出，“局部地区仍有暴发甲型H1N1流感疫情的可能。” 本次疫情患者感染的是一种H1N1亚型流感病毒新毒株，它包含人流感病毒、北美禽流感病毒和北美、欧洲、亚洲三类H1N1流感病毒的基因片段。这种病毒已被证实经由人际传播，人感染后会出现高烧、精神不振、厌食、咳嗽等症状。科学家指出，打喷嚏、咳嗽和物理接触都有可能导致甲型H1N1流感病毒在人群间传播。这次甲型H1N1流感病毒呈现的另一大特点是对青壮年攻击性强，目前确诊甲型H1N1流感死者中大多数年龄都在25 ~ 45岁之间。

实验动物背景信息

雪貂呼吸道解剖结构上下呼吸道分腔明显，受体分布与人极为接近，是迄今为止最为敏感的流感病毒感染动物模型。它对人流感病毒高度易感，病毒不经适应即能使雪貂致病，并易传播给雪貂和人。在自然条件下，雪貂一般也是通过呼吸道吸入病毒的方式感染流感病毒，其感染后的发病过程和机体反应也与人体相似。雪貂除对人流感病毒高度易感外，对禽流感、猪流感病毒也十分敏感，且感染后出现典型症状。

分子生物学研究显示，这是由于雪貂的呼吸道上皮细胞表面存在人流感病毒特异性受体α2,6糖键连接的唾液酸，而其肺泡上皮细胞表面也存在着禽流感病毒特异性受体α2,3糖键连接的唾液酸。

概括起来，相较于其他流感动物模型，雪貂的优势为：（1）雪貂感染流感病毒后的症状、发病机制和免疫反应与人类极为相似。（2）人甲、乙型流感病毒均可自然感染雪貂，这为在完全控制的群体内观察流感的传播规律和流感病毒抗原性的漂移和转变提供了可能。（3）雪貂的气管较长，这样就使其上、下呼吸道区室化，有利于研究流感病毒对呼吸道不同区域的效应差异。（4）雪貂作为动物模型比啮齿类大，易于监测其体温、脉搏和呼吸频率。（5）在小型动物中，雪貂是唯一感染甲型流感病毒后自然出现发热反应的动物模型。基于此，目前雪貂作为理想的流感动物模型已被广泛应用于流感发病机理等各方面的研究，为人类流感研究做出了重要贡献。

去势雪貂（Mustela Pulourius Furo），4-10月龄，500-1000克。实验前进行血清学检查，HI方法检测血清甲型H1N1抗体，抗体阴性为合格雪貂方可入组实验。

模型制作方法

雪貂经过轻度麻醉后滴鼻感染甲型H1N1病毒。实验的观察期为10天。皮下植入体温芯片用于监测体温、体重变化。每日观察雪貂临床症变化，在感染后第5天处死动物，取组织样本用于监测病毒复制动力曲线和动物感染后组织炎症反应检查。

模型表型数据

1.雪貂模型感染后临床表现

雪貂感染致死剂量的甲型H1N1病毒后表现出显著的临床症状变化，第2天摄食量减少，第3天活动减少，精神萎靡，眼半闭，呼吸微弱，对外界刺激无反应，呈濒死状态（图1）。根据其表现设立了评分标准：NIH提供的雪貂感染实验观察指标分为鼻部症状和活动度两个部分，具体指标见表1。雪貂感染甲型H1N1后的临床症状评分如图2所示。

图1 雪貂感染甲型H1N1病毒后的临床表现

表1 雪貂感染后临床评分标准

评分	鼻部症状	活动度
0	无症状	活跃
1	鼻部抽吸或打喷嚏	仍活动但不如开始活跃
2	流涕无法自控	警觉不活跃
3	口式呼吸	不活跃不警觉

图2雪貂感染甲型H1N1病毒后的临床症状评分

雪貂感染后第1天体温显著上升至40℃以上，随后逐渐下降到正常水平（图3）。感染后第4天开始体重显著下降，最高降幅达23% （图4）。

图3雪貂感染甲型H1N1病毒后的体温变化情况

图4雪貂感染甲型H1N1病毒后的体重变化情况

2.雪貂模型感染后病毒在组织中复制情况

攻毒后第7天安乐雪貂，取主要组织脏器进行病毒载量测定，结果显示气管、心、脾、肾及脑组织中均可检测到高载量的病毒。

表2 雪貂感染后病毒在组织中复制情况

组织	气管	心	脾	肾	脑
病毒滴度（TCID₅₀/g）	1.41	1.82	2.33	2.14	3.25

3.雪貂模型感染后病毒在上呼吸道中动态复制情况

雪貂感染甲型H1N1病毒后，每天刮取其上呼吸道拭子，检测病毒动态复制情况，结果显示鼻拭子中甲型H1N1病毒的携带情况显著高于咽拭子，咽拭子于感染后第4天达到峰值，鼻拭子在感染后2-5天均保持较恒定的高水平复制状态（图5）。

图5 雪貂感染甲型H1N1病毒后在上呼吸道中动态复制情况

4.雪貂模型感染后肺组织病理检测结果

病理结果显示，雪貂感染甲型H1N1病毒后肺部可见点灶状暗红色区域或片状病变，切面亦可见点灶状暗红色区域（图6）。

图6 雪貂感染甲型H1N1病毒后肺组织病理检测情况. A：正常肺组织对照（×40）；B：弥漫性间质性肺炎（×40）；C：弥漫性间质性肺炎（×100）；D：免疫组化显示感染甲型H1N1病毒的上皮细胞呈阳性（×100）。

5. 雪貂模型感染后特异性抗血清产生及持续情况

血凝抑制实验结果显示，雪貂感染甲型H1N1病毒后，于感染后第9天达到峰值，HI效价可达1：1280，感染后第19天抗体效价降至1：640，并可持续至感染后第89天（图7）。

图7雪貂模型感染后特异性抗血清产生及持续情况

动物模型的评价与验证

保存方式

合作方式

1.Lili Xu, Linlin Bao, Qi Lv, Wei Deng, Yila Ma, Fengdi Li, Lingjun Zhan, Hua Zhu, Chunmei Ma, and Chuan Qin. A single-amino-acid substitution in the HA protein changes the replication and pathogenicity of the 2009 pandemic A (H1N1) influenza viruses in vitro and in vivo. Virology Journal. 2010, 7:325.
2.Bao L, Xu L, Zhan L, Deng W, Zhu H, Gao H, Sun H, Ma C, Lv Q, Li F, Chen H, Zhang L, Qin C. Challenge and polymorphism analysis of the novel A (H1N1) influenza virus to normal animals. Virus Res. 2010; 151(1): 60-5.
3.Lili Xu, Linlin Bao, Jianfang Zhou, Dayan Wang, Wei Deng, Qi Lv, Yila Ma ,Fengdi Li, Huihui Sun, Lingjun Zhan, Hua Zhu, Chunmei Ma, Yuelong Shu , and Chuan Qin. Genomic polymorphism of the pandemic A (H1N1) influenza viruses correlates with viral replication, virulence, and pathogenicity in vitro and in vivo. PLoS ONE. 2011, 6(6): e20698.
4.Meng S, Liu Z, Xu L, Li L, Mei S, Bao L, Deng W, Li L, Lei R, Xie L, Qin C, Zhang L. Intranasal Immunization with Recombinant HA and Mast Cell Activator C48/80 Elicits Protective Immunity against 2009 Pandemic H1N1 Influenza in Mice. PLoS ONE. 2011, 6(5): e19863.

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