H5N1禽流感病毒小鼠模型-

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H5N1禽流感病毒小鼠模型

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疾病概述

禽流感依据其对禽类的致病能力大小可以分为三个程度：高致病性、低致病性和无致病性。其中高致病性禽流感包括H5和H7 两个亚型。但并非所有的H5 和H7 都是强毒株。人高致病性禽流感是由高致病性禽流感病毒某些亚型的毒株引起的人急性呼吸道传染病。由H5N1亚型禽流感引起的症状较重，病死率高。1997年，香港一名3岁的男童因感染禽流感而死亡，在随后的几个月中，共有18个人感染禽流感病毒，其中6人死亡。之后相继有 H9N2、H7N7 亚型禽流感感染人类和 H5N1 亚型再次感染人类的报道,禽流感与人禽流感的关系开始倍受关注。2003年12 月中旬开始至今,朝鲜、越南、泰国、韩国、日本和中国等10 余个亚洲国家先后暴发H5N1高致病性禽流感疫情, 并且再越南、泰国、柬埔寨以及印度尼西亚出现了人感染高致病性禽流感病毒病例。据最新资料报道，世界卫生组织已证实泰国、越南和柬埔寨以及印度尼西亚自2004年1月起截至到2005年8月20日共有112人感染，其中导致57人死亡。而H7N7感染引起的症状相对较轻仅以眼角结膜炎和轻微的呼吸道症状为主。追溯历史，有报道的第一次禽流感感染人的事件发生在上个世纪的70-80年代的几例以自限性结膜炎为临床特征的H7N7感染病患。最近的一次发生在2003年荷兰一家农场有近80名工人及家属被确诊为H7N7感染,他们以眼部感染和呼吸道症状为主,其中一名兽医死亡,他的家人未接触病禽但也被证实H7N7感染。这起事件具有有限的人传人的证据。

实验动物背景信息

小鼠对多种流感病毒敏感，一直被选择作为流感病毒研究的动物模型，不仅有完备的检测试剂，还有相应的基因敲除、转基因小鼠可用于机制方面的研究。小鼠多表达α-2，3SA受体，α-2，6SA受体较少，曾局限的认为小鼠较适合用于α-2，3SA受体结合的病毒研究，后有研究发现受体特异性并不影响某些病毒对小鼠的致病力和复制能力。

制作流感病毒感染动物模型多应用SPF级雌性BALB/c小鼠，4-6周龄。

模型制作方法

病毒株为H5N1 A/ Vietnam/1203/2004，小鼠经过轻度麻醉后滴鼻感染病毒。小鼠感染后观察14天，监测体重变化率。感染后分时间段处死小鼠，每个时间点收集相同数量小鼠肺、脾、脑、心等组织，进行病毒滴度测定和组织病理学检查。

模型表型数据

1、小鼠感染后临床症状变化

小鼠感染后呈现显著的体重下降，动作迟缓，对外界刺激无反应甚至死亡，感染后体征表现见图1。小鼠感染后第1天开始出现体重下降持续至全部死亡，体重下降率超过40%，见图2。小鼠感染后第4天开始死亡，感染后5天迅速内全部死亡，见图3。

图1 小鼠感染H5N1病毒后临床症状变化

图2 小鼠感染H5N1病毒后，(A)体重变化率；（B）存活率。

2、小鼠感染后病毒在组织中复制情况

进一步观察病毒在小鼠各组织中的复制情况，结果显示H5N1病毒在肺以外的多个组织中复制，如肝、脾、肾、肠中复制，脑中可以检测到极微量的病毒复制（见表1）。

表1 小鼠感染流感病毒后组织病毒滴度 (n=6)

病毒^a

病毒滴度 (log₁₀TCID₅₀ /组织)^b

肝

脾

肺

肾

肠

脑

A/SZ/406H/06

(H5N1)

3.62±1.11(2/6)

1.62±0.23(2/6)

3.50±1.92(6/6)

1.17±0.32(2/6)

1.38±0.27(2/6)

2.17±0.41(2/6)

^a 以 10⁶ TCID₅₀病毒感染小鼠.

^b 病毒滴度以log10TCID50±SD 表示

3、小鼠感染后组织病理损伤

小鼠感染5天后处死小鼠，解剖获取脑组织和肺组织，组织大体检查发现肺组织全肺充血，见图3。在感染后第1天,第3天和第5天分别处死小鼠，取小鼠肺组织进行病理检查，镜下观察发现肺组织炎症损伤随感染天数迅速加重，具体表现为肺组织呈炎性充血、出血、水肿、坏死、渗出的重度肺炎病理改变见图4。肺组织、肠组织、肾组织和脑组织进行免疫组化染色，结果在以上组织中可以观察到病毒感染的阳性细胞，见图5。

图3 小鼠感染后第5天处死小鼠，取肺组织，大体病理改变

图4 小鼠感染后第5天处死小鼠，取肺组织进行HE染色。（A）小鼠感染后1天肺脏病理组织切片（100X）；（B）小鼠感染后3天肺脏病理组织切片（100X）；（C）小鼠感染后5天肺脏病理组织切片（100X）。

图4 小鼠感染后第3天取肺组织、肠组织、肾组织和脑组织进行免疫组织化学染色，病毒感染阳性细胞呈褐色（箭头所示）。（A）肺组织（400X）；（B）肠组织（400X）；（C）肾组织（400X）；（D）脑组织（400X）。

4、H5N1禽流感病毒在同笼小鼠中的传播

设立H1N1病毒为阳性对照，H5N1病毒感染3只小鼠24小时后与未感染小鼠同笼放置，观察小鼠症状，并分时间点处死小鼠采集样本测定小鼠测定小鼠感染情况。结果显示H5N1病毒在同笼小鼠中不传播，H1N1病毒在同窝小鼠中传播（见表2）。与H1N1病毒感染小鼠同笼小鼠中有8/14小鼠被感染，病毒主要分布在呼吸道。

表2. H7N9病毒在同窝小鼠中的传播(n=7)

病毒^b	病毒滴度 (log₁₀TCID₅₀ /组织)^a
病毒^b	肺	鼻	被感染的同窝小鼠^c	体重下降^d	血清转化率 ^e
A/SZ/406H/06 A/CA/07/09	-	NP	0	0	0
A/SZ/406H/06 A/CA/07/09	1.92±0.32(8/14)	+(1/14)	8/14	11%(6/7)	4/7

^a 病毒滴度以 log₁₀TCID₅₀±SD表示

^b 每种病毒以10⁶ TCID₅₀感染3只小鼠此后与7只小鼠同笼饲养

^c同窝期间被证明感染小鼠数量 (n=14, 每个时间点 n=7)

^d小鼠体重下降 (7 mice per group)

^e HI 滴度高于 40

动物模型的评价与验证

保存方式

合作方式

1.Bao L, Xu L, Zhu H, Deng W, Chen T, Lv Q, Li F, Yuan J, Xu Y, Huang L, Li Y, Liu J, Yao Y, Yu P, Chen H, Qin C. Transmission of H7N9 influenza virus in mice by different infective routes. Virology Journal, 2014, 11:185
2.Xu L, Bao L, Yuan J, Li F, Lv Q, Deng W, Xu Y, Yao Y, Yu P, Chen H, Yuen KY, Qin C. Antigenicity and transmissibility of a new clade 2.3.2.1 avian influenza H5N1 virus. Journal of General Virology. 2013, 94, 2616–2626

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