图1 miR-146a Tg小鼠鉴定

A. 流式细胞术检测miR-146a Tg和WT小鼠胸腺、淋巴结、脾脏细胞中报告基因eGFP的表达水平。B. Real-time PCR检测miR-146a转基因和WT小鼠胸腺、淋巴结、脾脏细胞中成熟miR-146a的表达水平。数据以管家基因U6作为内参进行均一化操作。
二、miR-146a调控γδ T细胞、CD8+ T细胞的胸腺发育
（一）miR-146a Tg小鼠的淋巴结和脾脏肿大，淋巴细胞各个亚群的绝对数量增多。
在解剖小鼠的过程中发现，与WT小鼠相比miR-146a Tg小鼠的次级淋巴器官（淋巴结和脾脏）肿大十分明显（图2 A），这与万瑛教授课题组的研究结果一致。随后，将淋巴结和脾脏研磨，制备成单细胞悬液，进行流式细胞术的检测。结果显示，miR-146aTg小鼠淋巴结中的细胞总数，包括T和B淋巴细胞的绝对数量显著升高，并且T细胞较B细胞更为显著[（1083±124 vs. 374±62）×104，P＜0.001]。其中，T细胞各亚群（αβ T细胞，包括CD4+、和CD8+ T细胞以及γδ T细胞）的绝对数量均显著升高（图2 B）。

图2 miR-146a转基因小鼠脾脏、淋巴结增生，T、B细胞以及各T细胞亚群的绝对数量增加

A. 脾脏及双侧腹股沟、腋下、臂丛淋巴结取自7周龄、雌性WT小鼠（左）或miR-146a Tg小鼠（右）。脾脏、淋巴结肿大如图所示。B. 应用流式细胞术计数WT及miR-146a Tg小鼠淋巴结中的T、B细胞，CD4+、CD8+ T细胞，αβ、γδ T细胞的绝对数量。每组5只小鼠，7周龄，雌雄不限。B中每点代表一只小鼠，数值代表均数±标准差。统计学差异表示为：* P<0.05，** P<0.01，*** P＜0.001（Student T检验）。
（二）T细胞亚群相对数量的改变
除绝对数量增多外，淋巴结和脾脏细胞的流式细胞术检测结果还显示T细胞亚群间的相对比例改变：αβ T细胞亚群比例降低，γδ T细胞亚群比例升高；CD4+ T细胞亚群降低，CD8+ T细胞亚群升高。种变化趋势在淋巴结和脾脏中是一致的（图3）。

图3 miR-146a Tg小鼠淋巴结和脾脏中αβ T细胞和CD4+ T细胞比例降低，γδ T细胞和CD8+ T细胞比例升高
A~D. 流式细胞术检测miR-146a Tg及WT小鼠淋巴结中αβ 、γδ T细胞（A、B），CD4+、CD8+ T细胞（C、D）相对比例。E~H. 流式细胞术检测miR-146a Tg及WT小鼠脾脏中CD4+、CD8+ T细胞（E、F），αβ 、γδ T细胞（G、H）相对比例。流式图随机挑选每组结果中的一次；统计图中每点代表一只小鼠，数值代表均数±标准差。统计学差异表示为：* P＜0.05，** P＜0.01（Student T检验）。

（三）miR-146a Tg小鼠胸腺中T细胞发育异常
miR-146a Tg小鼠外周淋巴器官中，T细胞绝对数量的增多加以T细胞亚群相对比例的改变提示，或是胸腺中T细胞发育的异常导致外周T细胞绝对数量和相对比例的改变。检测了miR-146a Tg小鼠胸腺中T细胞发育情况。
胸腺中T细胞发育根据CD4和CD8分子的表达情况分为3个阶段：CD4- CD8-双阴性（Double negative，DN）阶段、CD4+ CD8+双阳性阶段、CD4+ CD8-或CD4- CD8+单阳性阶段；其中DN阶段的T细胞又可根据CD25和CD44的表达进一步分为DN1（CD25- CD44+）、DN2（CD25+ CD44+）、DN3（CD25+ CD44-）和DN4（CD25- CD44-）4个亚阶段。流式细胞术的结果显示：①miR-146a转基因动物的CD8+ SP T细胞相对比例降低，而处于其他发育阶段阶段的T细胞没有显著变化；②miR-146a Tg小鼠胸腺中γδ T细胞的比例降低（图4），这证实了上文中提出的假设，但值得注意的是其变化趋势与淋巴结、脾脏相反。

图4 miR-146a Tg小鼠胸腺中γδ T细胞、CD8+ T细胞比例降低

A~D. 流式细胞术检测miR-146a Tg及WT小鼠胸腺中DN、DP、SP （A、B）以及DN中DN1~4 （C、D）T细胞比例。E、F. 流式细胞术检测miR-146a Tg及WT小鼠胸腺中γδ T细胞相对比例。每组5到10只小鼠（7周龄，雌雄不限）。流式图随机挑选每组结果中的一次；统计图中每点代表一只小鼠，横线数值代表均数±标准差。统计学差异表示为：N.S. P＞0.05，** P＜0.01，*** P＜0.001（Student T检验）
三、miR-146a影响小肠上皮内淋巴细胞构成与功能，导致小鼠对DSS诱导的肠炎易感性增加
除了淋巴结、脾脏肿大外，在解剖miR-146a Tg小鼠的过程中还发现有10%到15%的动物其小肠肠壁有充血的现象，有的小鼠还有伴有腹泻。这些现象与肠炎症状类似。提示，系统性过表达miR-146a使小鼠易感肠炎。随后，采用一种广泛应用的肠炎模型——DSS诱导的肠炎模型，从整体水平研究miR-146a与肠炎的关系。
（一）系统性过表达miR-146a加重小鼠DSS诱导的肠炎
用3% DSS水溶液替换小鼠的日常饮水，让其自由饮用10天，诱导miR-146a Tg及WT小鼠产生肠炎。相比与WT小鼠，miR-146a Tg小鼠表现出更加严重的肠炎症状（图5），表现为：①较早出现腹泻、血便等症状；②体重下降较快；③较低的存活率。病理学检查同样发现，miR-146a Tg小鼠结肠末端充血或变薄，肠道中未见成型粪便；镜下结肠组织呈明显的坏死，结肠绒毛缺失，黏膜下层变薄或缺失，浆膜层变薄。上述结果说明，系统性过表达miR-146a会加重DSS诱导肠炎的症状及组织损伤程度。

图5 系统性过表达miR-146a加重DSS诱导的肠炎

miR-146a Tg小鼠及WT小鼠各10只（雌、雄各5只），用3% DSS水溶液替换其饮水，让小鼠自行饮用5天（C）或10天（A、B、D），每日观察小鼠生存状态并称量体重。A. miR-146a Tg及WT小鼠的生存曲线。B. miR-146a Tg及WT小鼠的体重降低百分数曲线。C. DSS诱导5天后，miR-146a Tg小鼠结肠末端肠壁充血（箭头所示）。D. DSS诱导10天后，H&E染色显示miR-146a Tg与WT小鼠结肠组织的病理改变。第一排为25倍视野，第二排为100倍视野。
（二）miR-146a Tg小鼠小肠IELs中γδ T细胞比例升高，并以Vγ1亚群为主
在胃肠道黏膜表面有大量散在分布的IEL，它们直接与外界环境接触，构成了抵御胃肠道感染的“第一道防线”，与肠道微环境的稳态及肠道炎症密切相关。IEL的细胞组成十分特别，它主要由80%以上的T细胞、少量B细胞或其他细胞构成，其中的T细胞又不同于外周淋巴组织（以αβ T细胞为主），γδ T细胞占了很大比例（图6）。
由于IEL中γδ T细胞在肠炎中的重要作用，应用流式细胞术对小肠IEL的组成进行了分析，发现miR-146a Tg小鼠小肠IEL中γδ T细胞比例升高，并主要以Vγ1亚群为主（图6）。

图6 miR-146a Tg小鼠小肠上皮内淋巴细胞中γδ T细胞比例升高，尤其是Vγ1亚群

小肠IELs分离自7周龄的miR-146a Tg（n=8）或WT（n=6）小鼠（雌雄不限），流式细胞术检测其中αβ T细胞、γδ T细胞（A、B）及其Vγ1、Vγ4亚群（C、D）比例。流式图随机挑选每组结果中的一次。统计图中每点代表一只小鼠，横线数值代表均数±标准差。统计学差异表示为：*** P＜0.001（Student T检验）。
（三）miR-146a Tg小鼠小肠IEL分泌较多的 IL-6、IL-1β和IL-17A
接下来检测了miR-146a Tg小鼠小肠IEL细胞因子的分泌功能。首先，分离miR-146a Tg和WT小鼠小肠IEL，用固相化的抗CD3抗体（1 μg/mL）联合抗CD28抗体（1 μg/mL）刺激培养，在体外活化6h或24h后收集培养基上清，ELISA检测其中促炎性细胞因子IL-17A、IL-1β、IL-6、TNF-α，以及IFN-γ的含量。结果显示，与WT小鼠相比，Tg小鼠小肠IEL促炎性细胞IL-1β、IL-6 和IL-17A分泌量升高；而INF-γ的分泌量不受影响（图7）。

图7 miR-146a Tg小鼠小肠IEL分泌较多的IL-17A、IL-1β和IL-6

小肠IEL分离自7周龄大miR-146a Tg和WT小鼠（雌雄不限），经固相化的抗CD3e抗体（1 μg/mL）联合抗CD28 抗体（1 μg/mL）刺激6h、24h后，收集培养基上清，ELISA检测其中细胞因子含量。统计图中每点代表一只小鼠，数值代表均数±标准差。统计学差异表示为：N.S. P＞0.05，* P＜0.05，** P＜0.01，*** P＜0.001（Student T检验）。